合成生物学助力细菌疫苗研发

细菌感染已成为全球第二大死亡因素,给人类健康与公共安全造成了巨大威胁。抗生素一直是治疗细菌感染最为主要的手段,但越来越严重的耐药问题给传统的抗生素疗法带来了严峻挑战。除了抗生素之外,疫苗被认为是防治传染性疾病传播最为科学、经济、安全和有效的手段,在人类抗击病原体感染斗争中发挥了重要作用。然而,细菌基因组庞大,致病机制复杂,研发疫苗存在有效抗原筛选、设计、制备难,抗原组合配伍难,有效性评价难,研发周期长等诸多瓶颈,导致细菌疫苗研发进展缓慢,尤其是临床常见的严重耐药致病菌尚无有效的疫苗可用。合成生物学是一门新兴的交叉学科,近年来在疫苗研究领域已经得到了广泛应用,包括抗原的筛选、理性设计、配伍组合,载体、佐剂和递送系统的设计以及免疫应答调控等。本文综述了细菌疫苗研究的现状以及耐药细菌疫苗临床试验研究进展,总结了合成生物学技术在几种重要类型细菌疫苗研发中的应用进展,最后对相关前景进行了展望。合成生物学在疫苗的形式、疫苗递送、疫苗的研制效率等方面为研究人员提供了更为广阔的空间,未来,应最大化地发挥合成生物学的优势,充分发展和应用合成生物学技术手段,建立科学、理性、有效、可行的管理制度,建设生物安全保障法律体系和监管措施,高效推动细菌疫苗研发,解决抗生素耐药问题,造福人类健康。

生物技术制药科研式实验教学的实践与体会

生物技术制药是当今世界科学发展中极为重要、极为活跃的领域。随着该产业的迅猛发展，对生物技术制药人才的需求也日益增加。鉴于此，第三军医大学从2007年开始在药学和生物技术本科专业开设了《生物技术制药》这门课程。该课程是一门新兴的交叉学科，目前国内开设本课程的院校较少，可借鉴的经验不多。教学实践过程中，本校通过充分利用国家免疫生物制品工程技术研究中心的平台优势，在该课程的实验教学中推广科研式的教学模式，取得了良好的效果，现将如何提高该课程实验教学质量的措施和体会总结如下。

医学检验专业实验教学的改革与实践

实验教学在医学检验专业教学活动中占有重要的地位。通过实验教学,不仅要让学生加深对理论知识的理解,掌握基本的实验方法和技能,还要注重培养学生的动手能力和创新精神[1]。然而,长期以来,传统的实验教学受到固定模式的束缚,实验课被视为理论课的补充,严重影响了检验医学专业的教学质量。随着教学改革的不断深入，针对传统的实验教学模式存在的问题，采取了一系列的改革措施，取得了良好的教学效果。1更新实验内容。紧扣临床发展医学检验专业的实验教材普遍存在教学内容陈旧，实验技术落后的问题，对临床上普遍采用的一些新型的、高通量的、自动化的检验方法技术未涉及。实验内容的老化造成了教学与临床的严重脱节，难以培养出高素质创新型的医学检验人才。

百日咳基因工程疫苗的研究进展

近年来,随着基因组学和生物技术的迅猛发展,对百日咳主要毒力因子和抗原成分的结构及功能有了更加深入的了解,为开发新一代百日咳基因工程疫苗奠定了基础。本文对百日咳基因工程疫苗,包括亚单位疫苗、DNA疫苗及百日咳杆菌的免疫机制的研究进展作简要综述。

肉毒毒素及其疫苗研究进展

肉毒毒素是目前已知毒性最强的毒素,是引起食物中毒的常见细菌毒素之一,也是重要的生物战剂之一。本文对肉毒毒素的结构、作用机制及其疫苗的研制进行了综述。

生物技术实验课教学质量的探索与思考

生物技术是一门交叉学科,同时也是一门实践性很强的课程,是连接基础理论与实验操作乃至科学研究的桥梁[1]。生物技术专业的学生大多数要走上基础和运用研究的道路,在专业课学习过程中打牢理论基础,加深对科学研究的认识、培养过硬的实验技能和分析解决问题的能力,对今后的学习和工作不无裨益。实验教学在生物技术教学过程中占有重要地位。

百日咳丝状血凝素分子中强免疫原性片段的筛选、克隆与表达

目的筛选百日咳丝状血凝素分子中强免疫原性的片段,并对其进行克隆及表达。方法采用生物信息学软件对丝状血凝素分子的结构进行预测,从中筛选出具有强免疫原性的片段FHAs。经PCR扩增,T-A克隆后,构建表达质粒pET-22b(+)-FHAs,酶切鉴定正确后测序。将测序正确的质粒转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白的表达,并对表达产物进行Tricine-SDS-PAGE分析及Western blot鉴定。结果从丝状血凝素分子中筛选出具有138个氨基酸的肽段FHAs,经PCR扩增,得到约400bp的目的基因片段,构建的重组质粒经双酶切和测序鉴定,证明质粒构建正确,重组工程菌pET-22b(+)-FHAs/BL21经IPTG诱导,目的蛋白的表达量在50%以上,主要以包涵体形式存在。Western blot分析证实该蛋白能与抗FHA单抗发生反应。结论筛选出的肽段FHAs具有强的免疫原性和免疫反应特异性,为百日咳基因工程疫苗的研究奠定了基础。

幽门螺杆菌黏附素HpaA重组蛋白的表达、纯化及晶体生长

目的构建幽门螺杆菌黏附素Hpa A的原核表达载体,并用纯化的重组Hpa A蛋白进行晶体培养,为其三维结构解析、基于结构的Hpa A抗原表位分析和黏附拮抗剂研究奠定基础。方法用生物信息学方法分析Hpa A蛋白序列二级结构并预测跨膜区,利用PCR技术扩增幽门螺杆菌标准株NCTC 26695编码Hpa A蛋白的hp0797基因非跨膜区片段,构建重组质粒并p ET22b(+)-r Hpa A,在大肠杆菌BL21(DE3)中IPTG诱导表达重组蛋白,经Ni离子亲和层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析纯化蛋白并分析其聚集状态。用Hampton Research结晶试剂盒搜索结晶条件,并系统优化,在上海同步辐射光源进行衍射实验。结果成功构建了重组质粒p ET22b(+)-r Hpa A,并在大肠杆菌BL21(DE3)中可溶性表达;重组Hpa A蛋白在溶液中以二聚体形式存在,SDS-PAGE分析单体相对分子质量约24 000,HPLC分析纯度达95%;培养出晶形较好的重组Hpa A蛋白单晶,大小约70μm×30μm×20μm,衍射分辨率2.03魡。结论利用经典的蛋白质表达、纯化技术和晶体培养技术,获得了衍射能力较强的重组Hpa A蛋白单晶,为其三维结构解析和基于结构的幽门螺杆菌疫苗研究提供了重要基础。

严重创伤患者凝血纤溶特点分析

目的探讨严重创伤患者凝血纤溶功能障碍,寻求反映创伤患者凝血纤溶功能障碍的敏感指标。方法选取54例严重创伤患者,分别在手术前及手术后第1天和第5天测定其血浆凝血酶-抗凝血酶复合物(TAT)、凝血酶原裂解片段(F1+2)、D-二聚体、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)5项指标水平,并与正常对照组(50例)进行比较。结果手术前患者组与对照组相比F1+2、TAT、D-二聚体差异均有统计学意义(P<0.05);手术后第1天这3项指标均达3次结果峰值(P<0.01),手术后第4天3项指标均稍有下降,但差异无统计学意义;3次测定结果中,APTT、PT结果与正常对照组差异均无统计学意义。结论严重创伤患者F1+2、TAT、D-二聚体升高,提示患者处于高凝状态,并有继发性纤溶亢进,在反映严重创伤患者凝血纤溶功能障碍中,这些分子指标优于常规凝血象检查。

重组表达幽门螺杆菌致病岛CagL蛋白及其中和抗体初步研究

目的重组表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)cagL基因,并制备兔抗多克隆抗体及阻断Hp黏附宿主细胞实验。方法用PCR方法扩增出cagL基因片段,将目的基因构建至表达载体pET22b中并诱导表达。采用亲和层析法纯化蛋白,以纯化蛋白为抗原免疫家兔,制备兔抗CagL多克隆抗体血清,并用多克隆抗体血清进行阻断Hp黏附宿主细胞实验及细胞因子IL-8活性分析。结果成功构建表达纯化了CagL重组蛋白,制备CagL蛋白兔抗多克隆血清,并初步验证了多克隆抗体血清在体外和Hp黏附作用的关系。与对照菌相比,重组菌CagL在25×103附近均出现新的蛋白表达条带,且诱导6 h时表达量最高。UVP扫描分析目的蛋白占菌体总蛋白的35%～40%。SDS-PAGE显示重组蛋白CagL主要以包涵体形式存在于超声沉淀中。ELISA结果显示兔抗CagL多克隆抗体的滴度为1∶16 000 EU。Giemsa染色后显微镜观察可见Hp菌与HeLa细胞呈典型的聚集性黏附,抗体中和后Hp与HeLa细胞未见黏附,加入DH5α的HeLa细胞也未见细菌黏附。结论多克隆抗体血清对Hp黏附定植有一定阻断作用,并且可以减少Hp促进细胞分泌IL-8的能力。

幽门螺杆菌黏附素A抗原H-2d（I-A）限制性免疫优势Th表位的筛选与鉴定

目的鉴定幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)黏附素A抗原(HpaA)H-2d限制性免疫优势Th表位,为H.pylori表位疫苗的研究提供候选表位。方法采用体外扩增的HpaA抗原特异性T细胞和步移重叠合成肽筛选鉴定HpaA抗原的免疫优势Th表位,再利用抗体阻断实验对其H-2d限制性进行分析。结果 18mer氨基酸肽段筛选发现肽段H154-171、H184-201、H190-207、H202-219和H220-237能够激发HpaA特异性CD4+T细胞产生γ-干扰素。其中H154-171激发的应答最强。13mer氨基酸短肽鉴定结果显示:仅H158-170能刺激产生强于18mer氨基酸短肽H154-171的应答反应。同时,抗体阻断试验结果表明:抗H-2d(I-A)抗体能有效阻断该表位激发的应答。结论 H154-171、H184-201、H190-207、H202-219和H220-237是HpaA的小鼠H-2d限制性Th表位,其中H154-171为免疫优势表位肽,该表位的核心氨基酸序列为H158-170,并存在H-2d(I-A)限制性。该研究将为H.pylori表位疫苗研究提供了可能的候选分子。

百日咳毒素S1亚单位突变体在大肠杆菌中的表达及纯化

目的克隆百日咳毒素S1亚单位,获得其突变体(S1/9K-129G,rS1),构建原核表达系统,并鉴定融合蛋白的特异性。方法采用PCR和重叠延伸扩增得到突变体,将其与pMD18-T连接,转化至大肠杆菌DH5α,筛选得到阳性重组克隆载体pMD18-T-rS1,经双酶切得到rS1活性结构域编码片段。将其插入pQE-30载体中,转化大肠杆菌M15株,经IPTG诱导表达。表达产物经镍离子柱纯化,并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果PCR及重叠延伸获得了约700bp的目的基因片段,并获得阳性重组表达载体克隆,表达产物为相对分子质量27000左右的蛋白,Western blot检测能与兔抗百日咳毒素多价抗血清发生反应。结论成功表达并纯化了百日咳毒素S1亚单位突变体,为研制百日咳疫苗候补抗原的相关分子免疫学研究奠定了基础。

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位优势Th表位的系统筛选与鉴定

目的筛选幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)尿素酶B亚单位(UreB)中CD4+细胞优势应答表位,并确定其MHC限制性。方法以重组UreB蛋白(rUreB)与弗氏佐剂联合皮下多点注射免疫BALB/c小鼠,从小鼠脾脏中体外扩增UreB特异性T淋巴细胞,采用步移重叠合成肽法筛选CD4+T细胞优势应答表位,分析其MHC分子限制性。结果 18mer短肽筛选发现UreB403-420和UreB409-426可显著刺激UreB特异性CD4+T细胞产生IFN-γ。13mer短肽鉴定实验结果显示,UreB409-421可刺激产生与18mer短肽UreB403-420和UreB409-426等同的应答强度。同时抗体阻断实验表明,抗H-2d(I-A)单克隆抗体能有效阻断该表位的应答。结论 UreB403-420和UreB409-426为UreB抗原中的优势Th表位,其刺激免疫反应的核心位置为UreB409-421,且存在H-2d(I-A)限制性。

百日咳杆菌毒素S1亚单位突变体的研究进展

百日咳杆菌毒素(PT)是目前无细胞百日咳疫苗中的主要保护性成分,其中PT的S1亚单位又是其主要的功能性亚基,具有免疫保护活性和多种毒性。在对多个S1突变体的生物学及免疫学研究后发现,其中的一个S1的双位点突变体(PTX-9K/129G)在保持有良好的免疫原性和免疫保护作用的基础上,大大降低了PT的毒性,有望成为理想的百日咳疫苗候补抗原。

重庆地区汉族人群HLA-DRB1等位基因多态性研究

目的了解中国重庆地区汉族人群人类白细胞抗原HLA-DRB1基因多态性及其分布特点。方法应用自行建立的聚合酶链式反应-测序为基础的分型方法(PCR-SBT)对190例重庆地区汉族人群进行HLA-DRB1基因分型和多态性分析。结果共检测出13种HLA-DRB1等位基因,20种等位基因型。其中,HLA-DRB1*09:01(29.1%)等位基因频率最高,其次为HLA-DRB1*04:05(12.2%)、HLA-DRB1*08:03(9.3%),基因频率最低的是HLA-DRB1*12:01、HLA-DRB1*12:02、HLA-DRB1*14:05和HLA-DRB1*15:02,各占1.26%。此外,检出的20种HLA-DRB1等位基因型在男女性别间无显著差异。结论成功建立并优化了HLA-DRB1的PCR-SBT基因分型方法;重庆地区汉族人群HLA-DRB1等位基因呈现多态性,为群体遗传和疾病关联的研究提供了可靠的遗传学数据。

产教融合思政案例库教学在“生物技术制药”课程体系中的实践探索

专业课程实施课程思政,对学生的职业政治觉悟及岗位服务意识有直接影响,生物技术制药作为应用性课程,产教融合是其理想的实施模式.目前产教融合与课程思政如何有机结合,是生物技术制药课程亟须解决的问题.本文在充分挖掘真实疫苗产业案例、典型研发方案的基础上,融入课程实践,并突出中国特色,强化课程思政效果,构建了产教融合的思政案例库.产教融合思政案例库教学在“生物技术制药”课程实践中培养了学生的自主创新意识,显著提升了本学科教育水平.

邻近营业线转体T构称重施工技术研究

结合徐盐铁路京沪上行线跨京沪高铁特大桥邻近营业线转体T构称重施工技术展开研究,阐述了徐盐铁路京沪上行线跨京沪高铁特大桥邻近营业线转体T构称重施工的作业方法及目的,因转体T构邻近营业线安全风险大,通过称重施工技术总结。在跨越繁忙交通线路与各桥梁施工中,为今后邻近营业线转体T构称重施工提供了一些可借鉴的经验。

摩擦压力机的摩擦带改用环氧树脂粘合修理

J53 300吨双盘摩擦压力机的摩擦带是叠片安装在飞轮1上,摩擦片2用压紧圈3及螺栓4联接拧紧(见图1的假想线);磨损后更换新摩擦片费料费工费时。为此,我们在旧摩擦片的外圆上粘接一圈摩擦带5代替更换新带。比原来可节约摩擦带材料45,使用寿命可延长0.5～1倍,停机修理时间缩短1/2。其修理方法如下:1.把已磨损失圆的摩擦片在立车上加工,使其外径低于飞轮外径3mm,并加工成中凹形。这样,能增加粘合强度,不易脱脂;加工后消除毛刺,如有油迹,用丙酮清洗干净。

连续梁预应力施工工艺工法

在大跨度桥梁施工中,预应力技术的广泛应用,使超大跨度桥梁的施工成为了可能,在施工过程中,预应力技术的施工工艺工法涉及到的问题相当广泛,该文就针对预应力技术在连续梁桥悬臂浇筑施工中应用的过程进行详细的工艺工法介绍。

重组金黄色葡萄球菌疫苗免疫血清中功能性抗体OPK检测方法的建立

目的建立重组金黄色葡萄球菌疫苗免疫血清中功能性抗体检测方法。方法在参考美国阿拉巴马大学的多重调理吞噬实验(UAB-MOPA)方法的基础上,构建并鉴定HL-60效应细胞库及金黄色葡萄球菌工作种子批,完成补体浓度、调理和吞噬孵育时间及血清预稀释倍数等关键实验参数的优选。在此基础上对5种不同来源金黄色葡萄球菌进行调理吞噬杀菌(OPK)活性的检测。结果 HL-60细胞经0.8%DMF诱导分化4 d后,CD35表达量为87.1%,CD71表达量为2.82%,活细胞比例为75.7%;靶细菌工作种子批冻存复活率>90%,工作稀释度>1 000;体系中补体终浓度确定为6%;选择30 min、60 min作为调理和吞噬孵育时间;血清预稀释倍数为2倍;疫苗免疫血清对5种不同来源的金黄色葡萄球菌均表现出良好的OPK活性及标准的"S"型杀菌曲线。结论本研究优化建立的OPK检测方法,可有效评价重组金黄色葡萄球菌疫苗的体外功能性抗体水平,为疫苗临床试验样本检测及免疫有效性替代终点的确立提供了重要的技术支撑。