铜绿假单胞杆菌QS相关基因差异表达的研究

选取100个与铜绿假单胞杆菌(Pseudomonasaeruginosa)群感效应(quorum-sens-ing,QS)相关的基因,克隆这些基因片段于pMD-18T载体,测序鉴定,点样制备cDNA基因芯片。制备cy3-dCTP/cy5-dCTP标记的探针,与芯片杂交。初步研究了处于不同生长期的铜绿假单胞杆菌基因的表达差异。指数中期和平台初期相比,有9个QS基因表达量显著增加,有6个基因表达量显著下降。利用芯片做针对铜绿菌假单胞杆菌药物的筛选妥布霉素(Tobramycin)给药后细菌基因发生差异表达。证明了该cDNA芯片用于药物筛选的可行性。在国内首次研制开发了QS相关基因的cDNA芯片。应用基因芯片技术建立的铜绿假单胞杆菌QS相关基因研究平台,为找到能较好抑制铜绿假单胞杆菌正常生长的药物研究提出新的解决方法。

16S rDNA用作荧光定量PCR靶基因快速检测铜绿假单胞菌

对20余种细菌16SrDNAs进行多序列比对与进化树分析,设计铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa,PA)荧光定量PCR(fluorescencequantitativePCR,FQ-PCR)特异性引物。提取PA基因组DNA,以特异性引物扩增16SrDNA靶片段,并构建重组质粒pMDT-Pfr。将梯度稀释的pMDT-Pfr质粒作为模板,用于建立定量标准曲线。以SYBRGreenI荧光染料建立20μL反应体系,对不同浓度的PADNA样品进行FQ-PCR检测。同时,以金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌、福氏志贺菌、变形杆菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌和结核杆菌的基因组DNA作阴性对照,验证FQ-PCR方法检测PA的特异性。结果显示,设计的FQ-PCR引物的靶向序列,仅对PA16SrDNA有高度同源性;FQ-PCR方法检测PA,其灵敏度达3.6pg/μL的基因组DNA或(2.1×103±3.1×102)拷贝/μL的16SrDNA基因,并且具有很强的特异性;从细菌DNA提取到FQ-PCR检测,可在2h左右完成PA鉴定。较传统的培养鉴定法而言,以16SrDNA作为FQ-PCR靶基因快速检测PA,具有很好的研究价值与应用前景。

炭疽芽胞杆菌染色体特异序列的筛选及实时定量检测

筛选117条炭疽芽胞杆菌（Bacillus anthracis）特异序列，经双重特异性验证后得到19条理想的特异序列（genomic signatures），其中6条符合设计TaqMan探针建立实时定量PCR的要求，根据常规PCR检测结果选择其中CO4片段与炭疽芽胞杆菌毒性质粒pX01、pX02上的pagA、capB基因建立实时定量PCR检测体系。经试验证实这一体系检测灵敏度达到每PCR反应10～100个拷贝。利用12种相关菌株评价后获得100％特异性，对10份模拟污染标本和20份对照标本检测，所有污染标本均被检出，所有对照标本均为阴性。此方法特异、灵敏、高效，在炭疽芽胞杆菌感染的诊断和环境污染的检测等领域有潜在的应用前景。

呼吸道合胞病毒和副流感病毒疫苗的研究进展

呼吸道合胞病毒 (RSV)和人副流感病毒 (h PIV)是引起儿童和高危成人下呼吸道疾病 (L RTI)的主要病原体。经过几十年的研究 ,尚未获得可以应用的疫苗。最近研制的基因工程减毒活疫苗已经进入临床试验评估。重组技术可以根据临床数据对疫苗进行调整 ,从而加速这些重要呼吸道病原体疫苗的研制。

丙型肝炎病毒E2蛋白HVR1在体液免疫应答中的作用

丙型肝炎病毒（HCV）感染是肝硬化、肝癌的高危险因素，目前尚无HCV疫苗上市。HCV包膜E2蛋白能诱导机体产生中和抗体，是重要的候选疫苗成分。E2蛋白氨基末端由27个氨基酸残基组成的高变区1（hypervariable region1，HVR1）含有多个线性中和抗体表位，变异频率极高，增加了HCV疫苗研制的难度。近年发现，除了HVR1含有中和抗体表位外，E2蛋白还存在其他的保守空间构象和线性中和抗体表位心。本研究构建了羧基端截短的含有HVR1和缺失HVR1的E2蛋白真核表达质粒，以之免疫小鼠，分析HVR1在E2蛋白诱导的小鼠体液免疫应答中的作用。

丙型肝炎病毒E2蛋白DNA疫苗诱导小鼠产生中和抗体的研究

目的探讨丙型肝炎病毒(HCV)包膜E2蛋白DNA疫苗诱导小鼠产生中和抗体的可行性。方法构建截除疏水性羧基末端的HCV包膜蛋白表达质粒pCI-1b661以及同时截除疏水性羧基末端和高变区1(HVR1)的表达质粒pCI-1b661Δ,转染293T细胞,以Western blot和ELISA检测细胞内和培养上清中的HCVE2蛋白,将两种表达质粒及空载体分别肌注免疫BALB/c小鼠,以ELISA检测小鼠血清中的HVR1抗体,以HCV假病毒颗粒(HCVpp)分析小鼠血清的中和活性。结果 2种表达质粒均能表达分泌性截短型E2蛋白。pCI-1b661免疫的8只小鼠血清中均可检测到HVR1抗体,而pCI-1b661Δ免疫血清中未检测到HVR1抗体。pCI-1b661和pCI-1b661Δ免疫血清对HCVpp的中和率分别为(78.5±13.8)%和(38.7±6.5)%,差异有显著性(P<0.01)。pCI-1b661免疫组小鼠血清的中和率与HVR1抗体水平呈正相关(r=0.967,P<0.01)。结论表达截短型E2蛋白的DNA疫苗能诱导产生HCV中和抗体,其主要成员为HVR1抗体。

丙型肝炎病毒包膜E2蛋白DNA疫苗诱导小鼠产生中和抗体研究

目的探讨HCV包膜E2蛋白DNA疫苗诱导小鼠产生中和抗体的可行性。方法分别构建HCV E2蛋白全长表达质粒pcDNA3.1-1a746、截除疏水性羧基末端的表达质粒pcDNA3.1-1a661以及同时截除疏水性羧基末端和高变区1(HVR1)的表达质粒pcDNA3.1-1a661Δ,转染293T细胞,以Western blot和ELISA法检测细胞内和培养上清中的HCV E2蛋白,将3种表达质粒以及空载体分别肌注免疫BALB/c小鼠,检测小鼠血清的E2及HVR1抗体,以HCV假病毒模型分析小鼠血清的中和活性。结果3种E2表达质粒均能有效表达HCV E2蛋白,其中pcDNA3.1-1a746质粒的表达产物不能分泌,而pcDNA3.1-1a661和pcDNA3.1-1a661Δ均能分泌表达E2蛋白。分泌表达E2蛋白可显著增强小鼠的抗体应答,pcDNA3.1-1a661免疫血清对HCV假病毒颗粒(HCVpp)的中和活性明显高于pcDNA3.1-1a661Δ免疫血清。pcDNA3.1-1a661免疫血清中的HVR1抗体量仅占总E2抗体的一小部分,却是中和抗体的重要成分。结论表达E2蛋白的DNA疫苗能有效诱导HCV中和抗体的产生,HVR1不仅是重要的中和抗体表位,而且能增强E2蛋白其他抗原表位的抗体应答。

丙型肝炎患者血清中的交叉中和抗体

目的分析HCV感染者血清中是否存在交叉反应性中和抗体。方法以分泌表达HCV包膜E2蛋白真核表达质粒转染的293T细胞培养上清液中的HCV E2蛋白作为检测抗原,建立检测HCV E2抗体的ELISA方法,检测48份HCV抗体阳性的慢性丙型肝炎患者血清,然后用免疫荧光分析血清与HCV全长包膜蛋白表达质粒转染的293T细胞的结合反应,再用5株HCV假病毒为模型分析阴性血清的病毒中和活性。结果48份抗-HCV阳性血清中,E2抗体阳性血清达36份,阳性率75%。免疫荧光分析的结果与ELISA检测一致。HCV E2抗体阳性血清对5株HCV假病毒的感染性均有不同程度的中和作用,中和活性与E2抗体水平相一致。结论丙型肝炎患者血清中存在交叉中和抗体,提示开发能诱导广泛交叉中和抗体的丙型肝炎疫苗或许具有可行性。