二穗短柄草BdGI基因表达及其蛋白互作分析

光周期是调控植物开花的主要途径之一,GI在光周期途径中是控制生理节律和开花的关键因子。为探索二穗短柄草(Brachypodiam distachyon)BdGI基因的表达模式和蛋白互作关系,本研究通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析BdGI基因在不同光照条件下和长日照下不同生长发育阶段的表达情况;运用酵母双杂交初步筛选出互作蛋白BdZTL,并用双分子荧光互补法(BiFC)和免疫共沉淀法(CoImmunoprecipitation)进行验证。qRT-PCR分析结果表明,BdGI基因在不同光照下和长日照下不同生长发育阶段的表达情况不同,且都保持一定的昼夜节律,并且受到光周期的调控;利用酵母双杂交检测到GI与ZTL蛋白存在互作关系,双分子荧光互补与免疫共沉淀检测结果验证了两者互作关系的真实性。综上所述,BdGI的表达受光周期调控,具有昼夜节律性,在光周期诱导二穗短柄草开花的过程中也具备一定的调控作用。本研究结果为GI基因的功能研究奠定了理论基础。

长日照条件下2个热带玉米自交系的蛋白质组学分析

【目的】对长日照条件下2个热带玉米自交系进行蛋白质组学分析,为揭示玉米在长日照下的开花分子调控机制提供理论依据。【方法】以光敏型(FT32)和光钝型(FQR273)热带玉米自交系为材料,利用串联质谱标签(TMT)技术筛选差异蛋白,并对其进行GO功能注释及KEGG信号通路富集分析,构建蛋白间的相互作用网络。【结果】从长日照条件下FT32和FQR273热带玉米自交系4叶期叶片样品鉴定出6082个有效蛋白,其中显著差异蛋白605个(107个上调表达,498个下调表达)。605个差异蛋白注释到生物学过程、细胞组分和分子功能三大类,共79个条目,其中在生物学过程分类中,主要注释为翻译过程、谷胱甘肽代谢过程和蛋白质折叠;在细胞组分分类中,主要注释为膜整体组分、细胞质和叶绿体;在分子功能分类中,主要注释为ATP结合、金属离子结合和核糖体结构组成。有140个差异蛋白富集到13条KEGG信号通路,其中主要富集在次生代谢物生物合成、卟啉和叶绿素代谢和氨基酸生物合成。磷酸合成、核糖体代谢和翻译过程是玉米叶片在长日照条件下的关键途径。对被功能注释的196个蛋白进行归类和深入分析,根据生物学功能将其分为四大类,分别为活性氧(ROS)体内平衡(33个)、蛋白代谢(59个)、相关转移酶(25个)及其他功能(79个)。【结论】在长日照条件下,光敏型FT32玉米相对于光钝型FQR273的ROS体内平衡能力和蛋白代谢相关蛋白及相关转移酶活性均呈下调表达,其他功能蛋白种类繁多且功能复杂,以不同的方式发挥作用。即在长日照条件下,光敏感FT32玉米叶片以核糖体代谢和翻译过程为主的调控系统,维持玉米正常生长。

高羊茅FaGI基因在拟南芥中异源表达及蛋白互作分析

为探究高羊茅FaGI基因的生物学功能,本研究利用酵母双杂交、双分子荧光互补和免疫共沉淀探究与FaGI互作的蛋白;通过农杆菌介导法将过表达载体p1300-FaGI遗传转化拟南芥,获得转FaGI基因拟南芥株系,以拟南芥野生型Col-0、过表达FaGI基因株系和gi突变体为材料进行转录组学测序并观察其开花表型。结果表明,利用酵母双杂交方法筛选出与FaGI互作的FaCO蛋白,并通过双分子荧光互补和免疫共沉淀证明了FaGI和FaCO在体内和体外存在互作关系;过表达FaGI基因拟南芥植株的开花时间比野生型Col-0提前约1.24 d;将FaGI-OE、gi与野生型比对,分别筛选出1963和92个差异表达基因(DEGs),与野生型植株相比,过表达FaGI基因株系的差异基因富集在与生长发育、光周期途径、激素合成和信号传导、碳代谢等相关生物过程和代谢通路。综上,FaGI影响光周期途径相关基因的表达,在长日照条件下过表达FaGI基因促进了拟南芥开花,同时该基因的功能具有多样性与复杂性,可作为高羊茅调控分子育种的目标基因。本研究结果为揭示FaGI基因的功能及其调控网络奠定了基础。

长日照条件下九叶期玉米的蛋白质组学分析

【目的】探明长日照条件下玉米九叶期差异蛋白的特性,为揭示玉米的分子机理提供生物学基础。【方法】以LP光敏感(NT32)和光钝感(NQR273)玉米自交系为试验材料,采用人工控制长日照条件(16 h光/8 h暗)的方法对试验材料进行处理,于九叶期采集幼嫩叶片,利用TMT技术对不同光敏类型自交系材料进行蛋白质组学分析,同时结合生物信息学分析,研究其在长日照条件下差异蛋白的表达特性。【结果】长日照条件下玉米九叶期叶片中共检测到差异蛋白191个,其中上调表达107个,下调表达84个;GO富集分析显示,差异蛋白主要参与核糖体的结构组成、半胱氨酸型肽酶活性及锰离子结合过程等生物学过程。蛋白水解和翻译过程是重要的分子功能类别。差异蛋白主要富集于次生代谢物的生物合成、谷胱甘肽代谢、卟啉和叶绿素代谢等通路。网络互作分析筛选到氨基酸合成、核糖体代谢过程是玉米在长日照条件下生长发育的关键途径。有79个差异蛋白具有功能注释,分别参与ROS体内平衡(19个)、贮藏物质保护(7个)、氨基酸代谢(8个)、其他功能基因(45个)。【结论】光敏感NT32玉米在长日照条件下ROS清除能力增强,贮藏物质保护能力及氨基酸代谢下降,其他功能基因以不同的方式发挥作用,即在长日照条件下,光敏感NT32玉米叶片以氨基酸合成、核糖体代谢过程为主的调控系统,维持了玉米的稳定生长。

二穗短柄草(Brachypodium distachyon)BdCO基因调控开花的转录组学分析

CONSTANS(CO)是植物光周期诱导开花途径中的关键基因之一。为探究BdCO在光周期途径中的分子调控机制,本研究对野生型二穗短柄草(Brachypodium distachyon)Bd21植株、过表达BdCO基因型二穗短柄草(CO_OX)植株和BdCO基因敲除型二穗短柄草(CO_A3)植株进行转录组测序分析,对差异表达基因进行GO和KEGG功能富集分析,最后观察三种植株的开花表型。结果表明,对比Bd21 vs CO_OX和Bd21 vs CO_A3的基因表达量,分别检测到1382个和773个差异表达基因;GO功能富集分析发现,Bd21 vs CO_OX的差异表达基因主要富集在小核仁核糖核蛋白复合物、snoRNA结合和rRNA处理中,Bd21 vs CO_A3的差异表达基因主要富集在类囊体、色素结合和光合作用中;KEGG通路富集分析发现,Bd21 vs CO_OX的差异表达基因主要富集在植物激素信号转导、真核生物中的核糖体生物发生、光合作用-天线蛋白和昼夜节律-植物等通路,Bd21 vs CO_A3的差异表达基因主要富集在MAPK信号通路-植物、真核生物中的核糖体生物发生和光合作用-天线蛋白等通路;在长日照条件下,CO_OX植株的开花时间比野生型Bd21的提前约1.90 d,CO_A3植株的开花时间比野生型Bd21的延迟约7.92 d。综上,BdCO影响光周期途径相关基因的表达,同时影响二穗短柄草的开花时间,说明BdCO在二穗短柄草的光周期途径调控开花的过程中发挥重要作用。

二穗短柄草BdFKF1基因表达、亚细胞定位及蛋白互作分析

FKF1在光周期途径中是响应蓝光节律表达的基因,在光周期途径中有重要的作用。为探索二穗短柄草BdFKF1基因的表达模式、亚细胞定位和蛋白互作关系,本研究通过RT-qPCR分析BdFKF1基因在长日照、短日照、连续光照、连续黑暗、昼夜颠倒和长日照下昼夜节律与光周期的调控;构建绿色荧光蛋白融合表达载体转化烟草观察亚细胞定位;同时运用酵母双杂筛选结合初步鉴定2个互作蛋白BdCDF1和BdGI,并用双分子荧光互补(BiFC)和免疫共沉淀法(Co-Immunoprecipitation)进行验证。RT-qPCR分析表明BdFKF1基因在长日照、短日照、连续光照、连续黑暗、昼夜颠倒和长日照下不同发育阶段都保持一定的昼夜节律并受光周期的调控。亚细胞定位显示BdFKF1基因编码的蛋白位于细胞核中;利用X-α-Gal检测到BdFKF1可能与BdCDF1和BdGI有潜在的互作关系,BiFC方法进行验证结果显示BdFKF1与BdCDF1有互作关系,BdFKF1与BdGI互作关系不明显。免疫共沉淀法检测结果表明Bd FKF1与BdCDF1和BdGI都有互作关系,以期为后续该基因的功能验证打下基础。

二穗短柄草BdCO基因表达与生物学功能分析

CONSTANS(CO)基因在光周期途径中发挥重要调控作用。本研究旨在探究CO基因在二穗短柄草(Brachypodium distachyon)中的生物学功能。通过实时荧光定量PCR分析表明Bd CO基因在长日照、短日照、连续光照、连续黑暗和不同发育阶段都呈现明显昼夜节律并受光周期调控。将构建的目的蛋白与绿色萤光蛋白融合表达载体注射入本氏烟草(Nicotiana benthamiana)中,发现BdCO定位于细胞核,预示该蛋白在细胞核中发挥作用。利用酵母单杂交技术筛选出与BdCO启动子结合的关键转录因子BdGI,通过双荧光素酶检测进一步证实BdGI对BdCO转录有激活作用。采用酵母双杂交、双分子荧光互补和免疫共沉淀三种方法证明了BdCO蛋白与BdFKF1蛋白、BdZTL蛋白分别在体内和体外存在互作关系。综上所述,BdCO基因表达受生物钟和光周期双重调控,该基因编码蛋白可能在细胞核内行使功能。