从12SrRNA基因片段序列研究20种蛇的系统发生关系

本文测定了中国产蛇亚目 2 0种蛇约 80 0bp的mtDNA 12SrRNA基因片段序列。所测序列与楔齿蜥的同源序列一起经ClustalX 1 8软件比对 ,共有 881个位点 ,其中变异位点有 4 94个。以楔齿蜥为外群 ,用NJ法构建了 4科 2 0种蛇的进化关系树 ,对这 2 0种蛇的系统发生关系作了初步探讨。研究结果表明 :所研究的 4个科2 0种蛇分成 4个支系。第一个支系包括蟒科的东方沙蟒和蟒 2种蛇 ;第二个支系为蝰科 3种蛇 ,即草原蝰、尖吻蝮、竹叶青组成一个单系群 ;眼镜蛇科的眼镜蛇和银环蛇构成第三个支系 ;游蛇科的 13种蛇构成了第四个支系 ,其中灰鼠蛇、乌梢蛇和赤链蛇组成一个支系 ,锦蛇属的 7种蛇组成一个单系群 ,然后它们与前一支系相聚。剩下的颈槽蛇属两种聚类后与赤链华游蛇构成一个支系 ,并与游蛇科其它蛇组成姐妹群。第四支系首先与第三支系眼镜蛇科聚类 ,第二支系蝰科构成了三、四支系眼镜蛇科和游蛇科的姐妹群 ,第一支系蟒科在系统树的最基部 。

鼠疫耶尔森菌pgm位点及其侧翼序列遗传变异的比较分析

目的 研究鼠疫耶尔森菌中国自然分离株 pgm位点及其侧翼序列的变异 ,了解不同疫源地菌株间的毒力差异 ,为鼠疫防治提供帮助。方法 比较分析现有 4株菌的 pgm位点及其侧翼序列的变异 ,采用PCR、等位基因特异性PCR扩增 2 6 0株中国自然分离株和 7株假结核耶尔森菌。结果 除锡林郭勒高原型和青海田鼠型菌株外 ,其他菌株均缺失了YP16 6 6的 70～ 87bp之间的 18bp碱基。 14 0 6bp处T的缺失仅存在于东方型菌株中。北天山东段型及西段A、B型 ,锡林郭勒高原型 ,青海田鼠型菌株的 pgm位点下游都没有IS10 0插入 ;锡林郭勒高原型和青海田鼠型菌株的色素沉着区有 1个IS2 85插入 ,在其下游 3kb区域还有 1个IS10 0插入。冈底斯山型和昆仑山A、B型菌株的 pgm位点上游侧翼区与其他菌株不同。36株菌的 pgm位点缺失 ,缺失的菌株主要集中在鄂尔多斯高原型 ,松辽平原B型 ,昆仑山A、B型 4种生态型菌株中。结论 北天山东段型及西段A、B型 ,锡林郭勒高原型 ,青海田鼠型菌株是中国鼠疫耶尔森菌中比较古老的菌株。锡林郭勒高原型和青海田鼠型菌株是一个独特的分支 ,建议归为第 4个生物型———田鼠型。北天山东段型及西段A、B型 ,锡林郭勒高原型 ,青海田鼠型菌株的 pgm位点 ,由于在其下游没有IS10 0插入 ,所以稳定、不易缺失?

鼠疫耶尔森菌基因组进化与生态位适应研究

目的 探索鼠疫耶尔森菌基因组进化的基本规律及其与该菌在自然界适应性演化之间的内在联系。方法 对 36株鼠疫耶尔森菌和 7株假结核耶尔森菌进行芯片比较基因组分析 ,鉴定差异区段 (DFR) ,并对 2 6 0株鼠疫耶尔森菌进行PCR验证 ,分析各DFR在这些鼠疫耶尔森菌中的分布 ,同时进行基因组岛分析。结果 在鼠疫耶尔森菌基因组中鉴定出 2 2个DFR ,基于DFR图谱 ,将鼠疫耶尔森菌中国分离株分成 14个基因组型。鼠疫耶尔森菌共有 2 1个基因组岛 ,其中 18个已存在于假结核杆菌中 ,余下 3个为鼠疫耶尔森菌独有。结论 探明了各基因组岛在鼠疫耶尔森菌和假结核耶尔森菌间的差异分布 ,探究了鼠疫耶尔森菌的起源进化 ;建立了鼠疫耶尔森菌基因组分型系统 ;建立了各基因组型别间的系统发育关系 ,初步揭示了鼠疫耶尔森菌基因组的进化规律及其与鼠疫耶尔森菌生态位适应和鼠疫疫源地扩展之间的关系 。

鼠疫耶尔森菌菌株91001全基因组序列测定及初步分析

目的 测定对人不致病的鼠疫耶尔森菌布氏田鼠疫源地菌株 910 0 1的全基因组序列 ,并通过比较基因组学研究 ,探索鼠疫耶尔森菌致病性的遗传学机制和进化路线。方法 采用全基因组鸟枪法测定 910 0 1菌株的全基因组序列 ,利用比较基因组方法对 910 0 1与另外 2株鼠疫耶尔森菌(CO92和KIM)的全基因组进行比较研究。结果 910 0 1菌株的基因组包括 1条染色体和 4个质粒 (pPCP1、pCD1、pMT1和pCRY)。pPCP1质粒长度为 96 0 9bp,与参考菌株基本一致 ;pCD1质粒是编码Ⅲ型分泌系统的质粒 ,长度为70 15 9bp,编码情况与参考菌株基本相同 ,但重排导致了质粒的结构与参考菌株存在差异 ;pMT1质粒长度为10 6 6 4 2bp,保留了较多的原始质粒片段 ,毒力相关基因与参考菌株没有差异 ;pCRY质粒是本研究中新发现的质粒 ,在国内外研究中未曾报道 ,这一质粒长度为2 174 2bp ,具有独立复制能力 ,有一群编码Ⅳ型分泌系统的基因。 910 0 1菌株的染色体长度为4 5 95 0 6 5bp,有 4 0 37个编码序列 (CDS) ,其中 14 1个是假基因 ;染色体中存在着非常丰富的插入序列 ,由于存在IS序列介导的基因组重排 ,910 0 1菌株染色体的结构与参考菌株存在较大差异。通过比较基因组学分析 ,初步确定了910 0 1菌株甘油降解阳性、硝酸盐还原阴性、阿拉?

中药材蛇胆的DNA分子标记鉴定研究

目的 运用分子标记技术鉴定药材蛇胆的真伪 ,以克服目前仅依据形态、显微特征及理化性状进行鉴别的不足。方法 分别从药材蛇胆的胆衣和胆汁、原动物棕黑锦蛇的肌肉和胆汁中提取DNA ,经PCR扩增得到约 40 0bp的 12SrRNA基因片段 ,并对该基因片段进行测序研究。结果 从少量药材蛇胆的胆衣和胆汁中可提得足够用于PCR扩增的DNA模板 ,扩增产物的测序结果表明同一动物的胆衣和胆汁、肌肉和胆汁的碱基序列完全一致。结论DNA分子标记技术可用于中药材蛇胆和胆汁的鉴定 ,提示该技术也可用于其他动物分泌物类型药材的鉴别。目前市场上药材蛇胆来源较复杂 。

从12SrRNA基因序列探讨8种鳄类的系统学关系

测得扬子鳄 (Alligatorsinensis)和暹罗鳄 (Crocodylussiamensis)的mtDNA 12SrRNA基因片段的部分序列 ,与GenBank中的 2种鳄及文献中 4种鳄的 12SrRNA基因相应片段 ,经比对后构建系统树。其结果显示 ,现存鳄类为单系起源 ,可划分为 3个科 ,即 :鳄科、食鱼鳄科和假食鱼鳄科。食鱼鳄与假食鱼鳄亲缘关系较近 ,支持将假食鱼鳄作为食鱼鳄科的一个属 ,与以形态学为基础的研究结果不同。在钝吻鳄科中 ,扬子鳄与凯门鳄亲缘关系较远 ,而与密西西比鳄的亲缘关系虽较近 ,但它们的确存在很多差异 ,两者 12SrRNA基因序列差异达12 12 % ,碱基的颠换数为 9。在基于碱基转换和颠换的NJ系统树及仅基于碱基颠换的NJ系统树中 ,前者支持扬子鳄与密河鳄间的亲缘关系较近 ,而后者支持扬子鳄与凯门鳄间的亲缘关系较近 ,说明扬子鳄与密河鳄间亲缘关系是值得研究的问题。因本文仅根据 12SrRNA基因部分序列来进行分析的 。

鼠疫耶尔森菌生物型变异遗传基础的研究和新生物型——田鼠型的提出

目的 探究鼠疫耶尔森菌生物型变异的遗传基础。方法 通过全基因组序列的比较分析 ,鉴定可能与生物型变异相关的基因突变 ,采用DNA测序和位点特异性PCR的方法 ,分析基因突变在鼠疫耶尔森菌自然分离株中的分布。结果 田鼠鼠疫自然疫源地菌株在毒力、生化表型和分子特征上与其他型别鼠疫耶尔森菌相差很大。所有脱氮阴性菌株的napA基因发生了突变 ,所有甘油利用阴性菌株的 glpD基因发生了突变 ,所有阿拉伯糖利用阴性菌株的araC基因发生了突变。结论 提出了一个新的生物型———田鼠型 ;相应糖醇代谢相关基因发生突变是 4个生物型变异的遗传基础。

鼠疫耶尔森菌全基因组DNA芯片的研制及用于比较基因组学分析

目的 研制鼠疫耶尔森菌全基因组DNA芯片 ,并将其用于比较基因组分析。方法 挑选出 4 0 0 5条鼠疫耶尔森菌基因 ,PCR扩增各基因 ,以纯化的PCR产物点样制备芯片 ,采用双色荧光杂交策略 ,进行芯片比较基因组杂交。结果 设计了若干质控杂交组合 ,芯片杂交结果与全基因组测序结果完全一致。

鼠疫耶尔森菌DNA标识序列的鉴定及其应用研究

目的 确定鼠疫耶尔森菌DNA标识序列 ,以用于鼠疫耶尔森菌的快速检测和鉴定。方法 通过芯片比较基因组杂交和PCR验证 ,鉴定鼠疫耶尔森菌DNA标识序列 ,针对标识序列设计特定的PCR引物。结果 鼠疫耶尔森菌基因组中存在 3个区段 ,共 2 8条基因 ,均是鼠疫耶尔森菌DNA标识序列。针对其中 3条基因设计PCR引物 ,能特异性扩增出鼠疫耶尔森菌 ,与来自其他非鼠疫耶尔森菌的DNA无交叉反应。结论 鼠疫耶尔森菌存在DNA标识序列 ,并能用于鼠疫耶尔森菌的快速检测与鉴定。

中华绒螯蟹线粒体COⅡ基因全序列测定

通过克隆测序方法 ,报道了中华绒螯蟹 (Eriocheirjaponicasinensis)线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅱ (COⅡ )基因全序列 .与已知甲壳动物线粒体同源序列的比较显示 ,绒螯蟹COⅡ基因的核苷酸组成及其编码的氨基酸组成与软甲类甲壳动物最相近似 .其序列组成与密码子使用对A、T核苷酸没有明显的偏倚 .对中华绒螯蟹COⅡ全序列及其序列特征的研究 。

多光谱眼底成像在糖尿病视网膜病变筛查中的应用

目的探讨多光谱眼底分层成像在糖尿病视网膜病变筛查方面的作用。方法按照诊断试验的研究方法,对解放军306医院2015年6—7月的13例糖尿病视网膜病变患者及9例对照者同时行多光谱眼底分层成像及眼底荧光血管造影检查,以眼底荧光血管造影检查的结果作为金标准,判断多光谱眼底分层成像对糖尿病视网膜病变的诊断价值。结果多光谱眼底分层成像诊断微血管瘤的灵敏度及特异度分别为84.0%及88.9%,约登指数为72.9%,阳性似然比及阴性似然比分别为7.57及0.18。阳性预测值及阴性预测值分别为91.3%及80.0%。结论多光谱眼底分层成像检查可以作为糖尿病视网膜病变的一种有效的筛查手段,具有较好的可靠性及诊断价值。

糖尿病足与糖尿病视网膜病变相关性分析

目的分析糖尿病足(diabetic foot,DF)与糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)的相关性及DR进展的风险因素。方法回顾性分析2010年12月—2016年4月诊断DF并同期行眼底照相明确DR分期的病例249例次,分析二者在疾病分级和分期的相关性;并分析上述资料中同一患者多次以DF住院治疗时DR的进展情况,以及DF无进展患者的糖尿病病程、糖化血红蛋白、甘油三酯及胆固醇对DR进展的影响。结果糖尿病患者的DF分级与DR分期呈现明显正相关(P<0.01,rs=0.6026)。在多次住院的DF患者中,DF无进展患者中有21例(70.0%)DR分期发生了进展,而DF有进展患者中有13例(76.5%)DR病变分期发生了进展,差异无统计学意义(P>0.05)。在DF无进展的患者中,DR无进展组糖化血红蛋白、胆固醇及甘油三酯均低于DR有进展组(P=0.0146、<0.001和<0.001)。结论 DF与DR的严重程度呈正相关,DF比DR的进展存在滞后性,糖化血红蛋白、胆固醇及甘油三酯可能是预测DR病变进展更为迅速而敏感的指标。

银环蛇心脏毒素类似物cDNA的克隆

采用SMART技术和RT PCR方法,从同一个银环蛇毒腺中克隆到了5种尚未报道过的心脏毒素类似物全长cDNA序列(MNCTL1 a、MNCTL1 b、MNCTL1 c、MNCTL1 d和MNCTL2)。5种序列中,MNCTL1 b、MNCTL1 c、MNCTL1 d和MNCTL2的长度均为505bp,包括5′非翻译区32bp,3′非翻译区212bp和其余261bp组成的一个完整开放阅读框;MNCTL1 a由于3′非翻译区24bp的缺失,全长cDNA仅为481bp。所得序列编码区部分与已报道的银环蛇心脏毒素类似物(cardiotoxin likeprotein)编码区cDNA序列的同源性达95.8%以上。我们克隆到的序列编码85个氨基酸组成的心脏毒素类似物前体,包括20个氨基酸的信号肽和65个氨基酸的成熟肽,与已知的心脏毒素类似物氨基酸组成有很高的同源性。运用AntheportV4.5软件分析,发现编码的蛋白质与眼镜蛇毒中心脏毒素有相似的结构和性质,推测它们可能有类似心脏毒素的功能。本研究首次报道了从同一个体的银环蛇毒腺中克隆到多个心脏毒素类似物全长cDNA序列,提示银环蛇心脏毒素类似物基因在该种蛇基因组中有多个拷贝,并在毒腺细胞中同时转录。

鼠疫耶尔森菌活疫苗株的比较基因组学研究

目的 揭示不同来源的鼠疫活疫苗株在基因组组成上的差异。方法 以芯片比较基因组杂交为主要研究手段 ,结合PCR验证 ,对 19株鼠疫活疫苗株进行比较基因组分析。结果 鼠疫活疫苗株基因组中缺失了大量基因 ,但也有某些大片段基因的拷贝增多。结论 不同来源的疫苗株在基因组组成上存在差异 ,构成了不同疫苗株的表型与使用效果具有差异性的遗传基础。

鼠疫耶尔森菌菌株91001的蛋白质组学初步研究

目的 建立鼠疫耶尔森菌的蛋白质组学研究方法 ,获得鼠疫耶尔森菌的基本蛋白质组数据。方法 以对人无致病能力的布氏田鼠疫源地菌株 910 0 1为研究对象 ,按照溶解性的不同分别收集菌体蛋白 ,以 3种不同方法 (Shotgun LC MS MS ,1D LC MS MS和2D MS)进行分析 ,将分析数据与基于 910 0 1菌株基因组全序列建立的蛋白质理论数据库进行比对 ,确定 910 0 1菌株本实验培养条件下所表达的蛋白组分。结果 Shotgun LC MS MS方法鉴定了 971种蛋白 ,1D LC MS MS鉴定了 915种 ,而 2D MS方法则鉴定了 2 33种蛋白质 ,三者合计为 1193种蛋白质 ,占基因组预测CDS的 2 8 7% (1193/414 3)。结论 不同的蛋白质组分析方法鉴定的蛋白质种类和数目都存在差异 ,为更全面地获得鼠疫耶尔森菌蛋白质组数据 ,有必要同时采取多种方法进行分析。

应用抑制削减杂交技术进行鼠疫耶尔森菌的比较基因组研究

目的 确定古典型鼠疫耶尔森菌的特有序列 ,为建立和完善该菌基因组分型系统提供可靠数据。方法 通过抑制削减杂交技术发现差异片段并应用PCR验证。结果 发现了 5个在不同生物型鼠疫菌间存在差异的DNA片段 ,其中一个 383bp的片段在来自天山山地灰旱獭、长尾黄鼠鼠疫自然疫源地的 30株鼠疫菌全部阳性 ,而来自其它鼠疫自然疫源地的菌株全部阴性 ,5株假结核耶尔森菌中有 2株 (生物Ⅰ型和Ⅱ型 )阳性。结论 该 383bp片段为天山山地灰旱獭、长尾黄鼠鼠疫自然疫源地的鼠疫菌所特有 ,此疫源地的菌株可能是我国较古老的鼠疫菌。

SARS相关病毒(BJ01株)的全序列及其比较分析

严重急性呼吸综合征(SARS)是一种新发现的急性传染病。对一株已确认为SARS病原体的冠状病毒(BJ01)进行了全基因组序列测定,并与其他已知病毒进行了比较分析。该病毒基因组全长为29.725kb,含11个可读框(ORFs),由1个稳定区和1个可变区组成,其中稳定区编码RNA依赖性RNA聚合酶,包括两个ORFs;可变区含有4个蛋白质编码序列(CDSs),分别编码病毒的4个结构蛋白(S,E,M,N蛋白)。此外,可变区还包括5个非典型的预测蛋白(PUPs)。此病毒基因的排列顺序与其他已知的冠状病毒一致。通过与已知RNA病毒的序列比对,可以确认该病毒属于冠状病毒科(Coronaviridae)。与GenBank中已知的5个SARS相关病毒全基因组序列的比较分析显示,已在30个核苷酸位置上检出序列差异,总体突变率为0.1％,其中15个变异位点在编码区,可能会导致蛋白质的氨基酸改变(异义突变)。S蛋白中已发现3处可能引起该蛋白质物化特征变化的变异,而该蛋白质可能参与病毒与宿主间的免疫反应.与病毒包膜形成相关的M蛋白中则已发现两处氨基酸变化。进化分析表明,SARS病毒可能不是来源于人类,但没有证据证明是人为制造的。为了阐明SARS相关病毒的病因学以及排除其他可能的SARS病原体的存在,仍需进行更深入的研究。

应用抑制消减杂交技术研究鼠疫菌与假结核菌基因组之间的差异

目的:研究古典型鼠疫菌与假结核菌ATCC29833基因组间的差异,为进一步认识鼠疫菌的起源与进化奠定基础。方法:通过抑制消减杂交技术比较两种细菌基因组间的差异。结果:与已测序的 3株鼠疫菌基因组进行同源性比较,发现了 259个假结核菌基因组中存在的特异序列,与基因库进行同源性比较发现了 10个假结核菌ATCC29833基因组中存在的新序列。结论:抑制消减杂交技术是一个简单而有效的比较近源微生物基因组之间差异的方法,鼠疫菌在进化过程中失去了大量的基因,假结核菌基因组之间也存在着一定的差别。

蛋白芯片筛选鼠疫耶尔森菌与巨噬细胞的蛋白相互作用

目的:利用蛋白芯片筛选鼠疫耶尔森菌的毒力因子,进一步揭示鼠疫菌与宿主之间相互作用的机制。方法:鼠疫菌毒力相关蛋白芯片筛选与小鼠巨噬细胞系774A.1可能有相互作用的蛋白质,免疫荧光试验验证筛选出的蛋白相互作用。结果:共筛选到17个可能与巨噬细胞有相互作用的鼠疫菌蛋白,并通过免疫荧光试验初步验证了其中8个蛋白芯片筛选试验中信号最强的蛋白与巨噬细胞的相互作用。结论:蛋白芯片技术可用于筛选病原菌与宿主之间的相互作用,有助于深入研究病原与宿主之间相互作用的机制。本研究筛选出的鼠疫菌蛋白与巨噬细胞的相互作用尚需深入研究和验证,以便最终确定这些蛋白在鼠疫菌致病机制中所发挥的作用。