全细胞催化剂pelB-Xln-DT构建及其在水解三七皂苷R1中的应用

设计带有EcoRV和XhoI酶切位点的上下游引物PCR扩增嗜热菌Dictyoglomus thermophilum DSM 3960的GH39家族的β-木糖苷酶Xln-DT编码基因,利用基因拼接技术将其重组至p ET-20b质粒中pelB信号肽基因的下游,重组质粒转化大肠杆菌表达宿主Escherichia coli BL21,构建分泌融合表达型基因工程菌pelB-Xln-DT。经异苯基-β-D-硫代半乳糖苷诱导,pelB-Xln-DT酶活为2.1 U/m L。粗酶液pelB-Xln-DT的最适温度为85℃,较原酶提高了10℃,最适p H为5.5,比原酶降低了0.5;pelB-Xln-DT在85℃下的热稳定性比原酶有了一定提高,保温1 h后酶活基本不变,保温2 h其剩余酶活为82.0%,而Xln-DT在85℃下保温1 h后其剩余酶活为70.4%;在p H 4.0~7.0的范围内,pelB-Xln-DT具有良好的p H稳定性。引入pelB信号肽后不但能够提高蛋白的可溶性表达,还能提高酶蛋白的热稳定性。以pelB-Xln-DT作为全细胞催化剂转化三七皂苷R1生成人参皂苷Rg1,研究了转化温度、转化时间、三七皂苷R1添加量、重复次数等因素对转化效率的影响。结果表明,全细胞催化剂用量1.0 U/m L,在温度37℃下,3 g/L的三七皂苷R1反应3 h后的摩尔转化率达到91.6%,重复利用10次后,转化率仍能达到46.7%,显示出pelB-Xln-DT良好的重复催化性能。

杨木屑木聚糖碱法提取及其制备低聚木糖的工艺研究

为充分利用杨树资源,以杨木加工废弃物杨木屑为原料,研究碱法提取木聚糖的工艺条件,并采取酶法制备低聚木糖。以质量分数为1%的稀硫酸预处理可以有效提高杨木屑木聚糖的得率,较对照组提高了2倍。对比3种碱液(NaOH、KOH和NaHCO 3)提取杨木屑木聚糖的得率,以NaOH提取的木聚糖得率最大。通过单因素和正交试验优化NaOH提取杨木屑木聚糖的条件,结果显示碱液质量分数10%,固液比1∶10(g∶mL),温度120℃下提取3 h所得的木聚糖得率可达到20.7%,且四因素对提取得率的影响显著程度依次为提取温度>碱液质量分数>提取时间>固液比。碱法提取杨木屑木聚糖酸水解后产物由88.69%D-木糖、4.76%纤维二糖和6.62%葡萄糖组成且不含有阿拉伯糖,说明碱法提取的杨木屑木聚糖支链上主要连有木糖。以碱法提取杨木屑木聚糖为底物,优化了来源于嗜热菌Dictyoglomus thermophilum的重组木聚糖酶XynB-DT的酶解适宜条件:在温度70℃,pH 6.0,酶用量3.00 U/mL,反应时间12 h后,杨木屑木聚糖水解产物中以木二糖和木三糖为主,并含有少量木四糖,降解率达86.2%。研究结果为杨木屑木聚糖的高值化利用奠定了基础。

定点突变提高β-木糖苷酶Xln-DT的酶活

笔者在前期研究中已从嗜热菌Dictyoglomus thermophilum中克隆并异源表达了一种β-木糖苷酶Xln-DT,通过获得高酶活、酶学性质优异的β-木糖苷酶Xln-DT突变体,进而提高其在生物燃料、食品和医药等行业中的应用价值。基于提高比酶活的目的,通过生物信息学方法确定了β-木糖苷酶Xln-DT可突变的关键氨基酸位点,在161、202和231位点处分别引入HIS/LEU、PHE/LEU和TRP,获得Xln-DT比酶活明显提高的突变型酶Xln-DT-202PHE和Xln-DT-202LEU,并分析比较突变前后的酶学性质。突变型酶Xln-DT-202PHE和Xln-DT-202LEU的酶活较Xln-DT分别提高了3.28和2.97倍,比酶活分别提高了2.86和2.54倍。Xln-DT-202PHE和Xln-DT-202LEU的最适pH下降明显,由6.0分别下降至4.5和5.0。Xln-DT-202LEU在75℃下保温2 h酶活维持不变,较Xln-DT在75℃下的温度稳定性相比有明显提高。Xln-DT-202PHE和Xln-DT-202LEU在pH 4.0~7.0的范围内保温24 h,仍能保持80%以上的剩余酶活力。突变型酶不但显著提高了酶的活力,而且热稳定性得到了极大的改善,为其在食品热加工等领域中的应用奠定了基础。

热解糖梭菌β-木糖苷酶的克隆表达及其水解木二糖的应用

对来源于Thermoanacrobacterium thermosaccharolyticum的糖苷水解酶39家族的β-木糖苷酶基因Tt-xyl39进行了重组表达和酶学性质的研究,为新型β-木糖苷酶的研发及应用奠定基础。通过比对T.thermosaccharolyticum 571的全基因组序列,从中克隆出一个新型β-木糖苷酶基因Tt-xyl39,并实现了在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中的成功表达。通过Ni-NTA亲和柱层析纯化,得到纯化后的β-木糖苷酶TtGH39。该酶最适温度为50℃,最适pH为5.5,在50和60℃下的半衰期(T_(50))分别为30和6 h,显示出极好的热稳定性;1500 mmol/L的葡萄糖浓度和1000 mmol/L木糖浓度可将酶活力分别提升2.41倍和1.47倍。这不仅表明葡萄糖和木糖对TtGH39具有显著的激活作用,还表明该酶在实际应用中具有很强的耐糖及抗水解产物的反馈抑制能力。TtGH39能有效水解木二糖生成木糖,在50℃、pH 5.5、酶量0.5 U/mg条件下水解0.2和4.0 mg/mL木二糖,3 h后木糖得率分别为99.1%和61.6%。因此,克隆表达的TtGH39是一种热稳定性较高、耐糖性能极强的β-木糖苷酶,有望能为木聚糖降解及其木糖衍生产品的开发利用提供一种新型生物催化剂。

英语幽默欣赏

煎锅太小了一天早上,一个人路过一座很窄的桥,这时他看见一个渔夫在他下面荫凉的河岸边钓鱼,河水深而平静,所以他停下脚步悄悄的去观看。几分钟过后,渔夫拉起线,线的末端有一条大而肥的鱼,渔夫从鱼钩上取下鱼并把它扔进河里,然后他把鱼钩和线又放进水里。

争做“三色”新青年

作为"青年大学习"系列活动之一,共青团福建省委于2018年8月发起"青年有信仰奋斗新时代"主题征文,旨在引导全省广大团员结合所见、所闻、所感、所悟,用文章表达青春的活力、奋斗的美好,领悟新思想、新时代的真正含义。本刊分期陆续选登此次征文作品。