HIV-1p24蛋白在大肠肝菌中的高效可溶性表达、一步纯化及抗原性分析

合成引物扩增HIV 1p2 4基因 ,并将其克隆到 pQE 30质粒中 ,使其在大肠杆菌E .coliM 15中以IPTG诱导高效表达 ,经SDS PAGE分析 ,该表达产物约占菌体总蛋白 2 0 % ,并且以可溶蛋白的形式存在于细菌裂解液上清之中。经镍离子柱亲和层析一步纯化 ,洗脱产物中 p2 4蛋白纯度达95 %。ELISA分析表明 ,该蛋白可与HIV感染者血清发生特异性免疫反应。以此蛋白交联Sepharose 4B ,亲和层析纯化HIV感染者血清中的抗体 ,用所得抗体与HIV确认试剂反应 ,发现该纯化抗体仅与确认试剂中的 p2 4蛋白反应。上述结果表明在大肠杆菌中已经高效表达了可溶性HIV 1p2 4蛋白 。

HBV X基因在大肠杆菌中高效表达及血清抗X抗体检测

本文分别用大肠杆菌(E.colf)的Lpp启动子和M13噬菌体的geneⅡ启动子表达了分子量约为17 kDa的HBx蛋白,并以抗合成X多肽抗血清和抗X融合蛋白抗血清对该重组蛋白进行了分析鉴定(用ELISA法和Western印迹法),然后用重组X蛋白检测肝病病人血清中抗X抗体。我们采用一种改进的ELISA方法检测了212份血清标本,结果表明:肝硬化,慢活肝、肝癌、慢迁肝和急性乙型肝炎病人血清中抗X抗体阳性率分别为49.3%、47.6%、37.8%、29.6,6和40.0,6,高滴度的抗体主要存在于肝硬化和慢活肝病人血清中。

重组完整抗体研究进展

重组分子抗体是一类潜在的治疗用药物 ,约占目前进入临床试验的生物制品类药物的三分之一 ,FDA批准上市的抗体药物有近十种 ,其中多数为重组的完整人源抗体 (包括人鼠嵌合抗体和人源化抗体 ) 。

中国人β神经生长因子前体基因的克隆及其序列分析

从正常人外周血白细胞中提取基因组ＤＮＡ，用ＰＣＲ扩增神经生长因子（ＮＧＦ）β亚基前体的全长编码区序列，将其克隆到Ｔ－ｖｅｃｔｏｒ（原始质粒为ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＳＫ（＋））上，取两个独立的克隆采用自动测序仪进行双链ＤＮＡ双向测序，结果表明：两个克隆的序列完全相同，该序列与国外报道的ＮＧＦ序列有一个碱基的差别，从而导致ＮＧＦ前导肽中一个氨基酸的改变，而成熟的ＮＧＦ序列没有改变。

野外采集标本中人埃立克体16S rRNA基因扩增方法及应用

本文应用特异引物 ,通过多对半巢式PCR从采自内蒙古大兴安岭的蜱标本中扩增出人粒细胞埃立克体和查菲埃立克体的 16SrRNA全基因 ,一方面提供了这 2种埃立克体存在于中国的证据 ,另一方面为今后进行埃立克体病的病原、媒介和宿主的调查研究提供了一个可行的方法。并从一只大林姬鼠的脏器中检测到EC

携带共扩增基因的CHO细胞表达载体的构建

目的构建携带共扩增基因的CHO细胞表达载体。方法以质粒载体 pCI neo为骨架 ,应用小鼠二氢叶酸还原酶(dhfr)基因的cDNA ,构建了哺乳动物细胞表达载体pCdhfr1。把绿色荧光蛋白基因亚克隆到pCdhfrl的多克隆位点 ,构建了表达质粒 pFP。结果经脂质体法转染CHO细胞 ,以氨甲喋呤为选择标记 ,经过一轮扩增后 ,获得表达绿色荧光蛋白的CHO细胞株。结论应用CHO/DHFR表达系统 ,为构建CHO细胞的工程细胞株建立了良好的模型。

重组BPI_(23)-Fcγ1融合蛋白在CHO细胞中的表达

The fusion gene of BPI 23 and human Fcγ1 was obtained by PCR method,and the expression plasmid was constructed to express recombinant BPI 23 \|Fcγ1 fusion protein in CHO cells.After transfection with the plasmid and selection by methotrexate,the cell lines expressing the fusion protein were obtained.The recombinant protein was purified using cation\|exchange chromatography and its bioactivity was proved with bactericidal assays.

抗rh-bFGF嵌合抗体真核表达载体的构建与表达

目的 :构建并在真核细胞中表达抗人重组碱性成纤维生长因子 (rh bFGF)人 鼠嵌合抗体。方法 :从分泌抗rh bFGF鼠单抗(mAb) 1F11的杂交瘤细胞中扩增、克隆VL、VH 基因 ,从质粒pMDHC和pMDLC中扩增、克隆CL、CH 基因 ,测序鉴定后插入真核表达载体 ,并转化二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢(CHO dhfr- )细胞进行表达。采用间接ELISA检测表达产物的人源性和其抗原结合活性。结果 :序列测定表明所克隆的抗体基因是功能性抗体的V区基因 ,在转化细胞的培养上清中可检测到抗rh bFGF嵌合抗体的表达。ELISA试验证实 ,该嵌合抗体具有人源C区 ,并具有鼠mAb 1F11的抗原结合活性。结论 :在真核细胞中成功地表达抗rh bFGF的人 鼠嵌合抗体 。

一株裂解性奶牛乳房炎源屎肠球菌噬菌体的分离及其生物学特性分析

从新疆石河子地区奶牛粪样中分离裂解性屎肠球菌噬菌体,对其进行纯化及生物学特性分析,为治疗和控制细菌性感染提供基础。利用双层平板培养法从奶牛粪样中分离、纯化噬菌体,并观察噬菌斑特征,将纯化后的噬菌体浓缩液用磷钨酸负染,通过透射电子显微镜观察其形态特征。对该噬菌体进行全基因组测序和遗传进化分析,用双层平板培养法测定其宿主谱、最佳感染复数、一步生长曲线、热稳定性及pH稳定性。结果如下:分离并纯化出一株裂解性屎肠球菌噬菌体,命名为vB_EfaM_XJ3,其噬菌斑圆形透明、无晕环且边缘整齐,直径1.2~1.5mm;电镜观察其头部呈廿面体,头长约53.15nm,尾长约14.42nm×199.62nm;核酸类型为dsDNA,基因组全长为157.189kb,GC含量为50.27%;其基因序列与沙门菌噬菌体SKML-39的相似性高达98%。生物学特性研究显示vB_EfaM_XJ3目前只裂解其宿主菌;最佳感染复数为0.001,潜伏期为15min,爆发期为175min,裂解量约为84;能耐受50℃左右高温,在pH 5.0~11.0范围内效价稳定。分离鉴定出一株裂解性肌尾科屎肠球菌噬菌体,对它进行了生物学特性和亲缘性分析,为沙门菌和屎肠球菌抑菌剂的研究与应用奠定了基础。

利用高通量测序快速检测H7N9禽流感病毒及基因组序列分析

目的探索用高通量测序技术检测咽拭子样本中H7N9禽流感病毒的方法。方法分别提取编号为106、089及024 3份样本RNA,反转录,cDNA扩增,用Ion Torrent进行高通量测序,对测序结果进行生物信息学分析。结果 3个咽拭子样本的测序结果中均能检测出禽流感病毒,拼接出的基因组序列可以进行生物信息学分析。结论利用高通量测序技术可以快速地检测H7N9禽流感病毒,并可用生物信息学软件拼接基因组序列及进行序列分析。

利用DREAM设计和同源重组进行一步定点突变

目的:建立基于DREAM设计和同源重组的简便、快速定点突变方法。方法:设计两条包含突变的反向PCR(inverse PCR)引物,使其5′端互补从而产生同源重组,同时使用DREAM设计方案在上述引物中引入限制性内切酶位点以便突变子筛选。用能扩增长片段的高保真耐热DNA聚合酶扩增全长的质粒DNA,直接转化大肠杆菌。转化到细菌中的全长质粒DNA PCR产物可利用其末端同源序列发生同源重组而环化。利用引入的酶切位点方便地进行突变子的筛选。结果:用该方法成功地对长度大于7kb的质粒进行了定点突变。结论:本定点突变无需任何突变试剂盒和特殊的试剂,只需一步反应即可完成;利用DREAM设计使克隆筛选简便可靠,高保真耐热DNA聚合酶可保证多数突变子克隆不发生意外突变,而该酶扩增长片段的能力使该方法适合于大多数质粒不经亚克隆直接突变。

应用聚合酶链反应技术快速诊断腹水中大肠杆菌感染

应用聚合酶链反应技术快速诊断腹水中大肠杆菌感染陈乃玲童贻刚苑公忍顾芳田惠英韩春风贾克明作者单位：北京１００７００北京军区总医院解放军肝病研究所目前国内外对腹水感染的诊断主要依靠细胞数检测、生化分析、鲎试验及细菌培养，利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术尚未...

抗人整合素ανβ_3 单抗E10鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体的构建和表达

为构建抗人整合素ανβ3单抗E10鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体表达载体,并在噬菌体表面表达,采用PCR方法从整合素ανβ3单抗E10ScFv载体中,扩增重链可变区VH和轻链可变区VL基因。将VH基因与人重链恒定区CH1基因连接,VL基因与人CK基因连接,分别构建了鼠/人嵌合重链FD基因和轻链基因,将其克隆入pComb3,构建了鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体表达载体,用辅助噬菌体VCSM13超感染,间接ELISA及竞争抑制ELISA检测鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体活性。结果成功构建了鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体表达载体,并在噬菌体表面展示了可结合人整合素ανβ3抗原的鼠/人嵌合Fab抗体。

抗人整合素ανβ_3单链抗体的构建和表达

目的 :利用基因工程抗体技术构建抗人整合素ανβ3 单链抗体(scFv)。方法 :从分泌抗人整合素ανβ3 单抗 (mAb)的杂交瘤细胞E10总RNA中 ,用RT PCR扩增VH 和VL 基因 ,对其核苷酸序列分析后 ,通过PCR在VH 和VL 基因间插入柔性连接子(Gly4Ser) 3,组装成scFv基因 ,并克隆至原核表达载体pTIG TRX中。以重组子转化大肠杆菌BL2 1(DE3 )诱导目的基因表达。结果 :转化菌可表达相对分子质量 (Mr)为 3 10 0 0的scFv。Westernblot证实 ,具有His6标签蛋白的表达。经低剂量的IPTG诱导和较低温度培养 ,scFv获得了可溶性形式表达。表达产物经Ni NTA琼脂糖层析纯化后纯度达 91%以上。ELISA鉴定证实 ,scFv具有良好的抗原结合活性。结论 :成功地构建并表达抗人整合素ανβ3 的scFv ,为进一步临床研究奠定了基础。

一株粪肠球菌噬菌体的分离及其生物学特性研究

目的:利用临床耐药粪肠球菌分离裂解性噬菌体,为应用噬菌体治疗耐药粪肠球菌感染提供基础。方法:利用噬菌斑实验分离噬菌体并观察噬菌斑形态;双层平板培养法测定噬菌体效价、最佳感染复数及一步生长曲线;负染法电镜观察噬菌体形态;蛋白酶K/SDS法提取噬菌体基因组,酶切处理后琼脂糖凝胶电泳分析。结果:分离出一株噬菌体IME-EF1,该噬菌体能裂解多株临床分离的粪肠球菌;电镜观察呈蝌蚪形,最佳感染复数为1;通过绘制一步生长曲线,证明该噬菌体感染后的潜伏期为25 min,爆发期为35 min,裂解量为60 pfu。结论:研究结果表明利用临床分离的耐药粪肠球菌分离裂解性噬菌体是可行的,有望为耐药粪肠球菌的抗生素替代疗法奠定基础。

用于大容量人源天然噬菌体抗体库的表达载体的构建及鉴定

目的构建一个应用于大容量Fab段天然噬菌体抗体库的表达载体。方法用定点突变技术将表面呈现噬菌粒载体pDF上的BssHⅡ酶切位点改为BglⅡ酶切位点,然后分别在抗体轻链和重链位置插入自杀基因SacB,构建含自杀基因的噬菌粒载体pDF-D-SacB;利用抗乙肝表面抗原抗体的基因为模板,PCR扩增重链和轻链基因片段。将PCR扩增的轻链基因和重链基因分别插入载体pDF-D-SacB内,利用电转化的方法将其转入Trans1-Blue大肠杆菌,构建2个初级质粒,再利用初级质粒超感染BSl365菌,使其轻链与重链发生重组,获得重组质粒,进一步获得抗乙肝表面抗原抗体的噬菌体。之后利用该噬菌体感染大肠杆菌Trans1-Blue进行扩增,得到大量抗乙肝表面抗原的噬菌体抗体。最后,通过酶联免疫吸附剂测定检测所获得的抗体。结果通过向pDF重轻链区域插入SacB基因,改造抗体基因克隆位点,构建了pDF-D-SacB载体;经检测,pDF-D-SacB可以表达具有功能的Fab噬菌体抗体,可以在分泌Cre蛋白酶的细菌胞内发生预期的Cre-Loxp介导的定点重组。结论所获得的含自杀基因的噬菌粒载体pDF-D-SacB适用于构建大容量噬菌体抗体库。

金黄色葡萄球菌噬菌体对奶牛乳腺炎的治疗效果

试验通过双层平板法,分离纯化得到了奶牛乳腺炎的主要致病菌金黄色葡萄球菌的噬菌体.该噬菌体为典型的正六面体,其头部直径约60nm,尾部长约200nm;该噬菌体的最佳感染复数为0.01,且可作用在宿主菌的不同生长阶段,对宿主菌有明显的杀菌效果.通过临床实验发现,该噬菌体对奶牛乳腺炎具有显著的治疗效果.

Autodock Vina与Discovery Studio在虚拟筛选耐药蛋白抑制剂中的比较

随着大量与细菌耐药相关的基因的发现和其表达蛋白结构的成功测定,从已有的化合物中通过计算机模拟方法筛选对耐药蛋白靶点有作用的候选化合物,成为了药物发现的一个标准途径。虚拟筛选在耐药基因抑制剂的发现中可以提高效率、降低实验成本。本文介绍了Autodock Vina和Discovery Studio在基于分子对接法的虚拟筛选中的使用,并对比分析其对β-内酰胺酶活性位点的筛选结果。希望通过这种比较促进虚拟筛选在药物设计领域中的应用,提高耐药基因抑制剂的发现速度。

热激蛋白70的研究进展

热激蛋白(HSP70)作为分子伴侣参与细胞内许多重要反应,从而对生物体起着重要的作用。随着研究的深入,其生物学功能不断被发现和利用的同时,HSP70的应用前景也变得越来越广泛。已有研究者对HSP70的生物学功能做了详细介绍,我们主要对近年来HSP70在医学及环境监测等方面的应用进行综述。