一种鰑鱼诺卡氏菌酪氨酸蛋白磷酸酶基因的克隆及功能初步研究

這鱼诺卡氏菌是鱼类诺卡氏菌病的主要病原,可导致鱼类慢性系统性肉芽肿疾病。這鱼诺卡氏菌全基因组序列分析发现了一个酪氨酸蛋白磷酸酶(protein tyrosine phosphtase,PTP)基因,生物信息学分析显示该基因很可能编码一个靶向定位于宿主细胞线粒体的分泌蛋白。本实验对這鱼诺卡氏菌PTP进行了基因克隆、分泌蛋白鉴定、亚细胞定位、过表达和线粒体膜电位检测,结果显示,在這鱼诺卡氏菌胞外产物中质谱鉴定到了PTP肽段,证实其为分泌蛋白。亚细胞定位研究观察到PTP-GFP融合蛋白均匀地分布在FHM细胞中,与线粒体分布不重合,说明這鱼诺卡氏菌PTP蛋白并未靶向定位于线粒体。亚细胞定位和过表达研究都显示PTP蛋白在FHM细胞中表达后,细胞核出现固缩浓染、凋亡小体等明显的细胞凋亡特征。通过线粒体膜电位检测表明,在pcDNA-PTP转染后48 h,线粒体跨膜电位被明显破坏,说明這鱼诺卡氏菌PTP很可能是一种可诱导细胞凋亡的细菌蛋白。通过对這鱼诺卡氏菌PTP开展基因克隆和功能初步研究,为进一步揭示该基因的功能和深入了解這鱼诺卡氏菌的分子致病机理奠定了基础。

鰤鱼诺卡氏菌DmpA基因的克隆及亚细胞定位研究

鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)是鱼类诺卡氏菌病的主要病原,为兼性胞内菌。生物信息学分析显示鰤鱼诺卡氏菌DmpA基因的表达产物为分泌蛋白,且可能定位于宿主细胞的线粒体上。通过构建重组质粒p EGFP-DmpA和pc DNA-DmpA、鰤鱼诺卡氏菌胞外产物鉴定、亚细胞定位、过表达等方法,对鰤鱼诺卡氏菌DmpA基因进行了克隆、亚细胞定位及初步功能研究。结果表明在鰤鱼诺卡氏菌胞外产物中鉴定到了DmpA蛋白,证实其为分泌蛋白。亚细胞定位研究发现DmpA-GFP融合蛋白均匀地分布在FHM细胞中,与线粒体分布不重合,说明DmpA蛋白并不定位在线粒体上。DmpA-GFP融合蛋白的表达会改变FHM细胞线粒体的分布为团块状。DmpA在细胞中的过量表达对细胞核无明显影响,表明该基因无诱导细胞凋亡的功能。通过对鰤鱼诺卡氏菌DmpA的克隆、亚细胞定位和过表达研究,为进一步研究该基因的功能和深入了解鰤鱼诺卡氏菌的致病机理奠定了基础。

鱼诺卡氏菌动力蛋白调节蛋白robl/LC7的亚细胞定位和功能初步研究

鱼类诺卡氏菌病是一种慢性系统性肉芽肿疾病,鱼诺卡氏菌是其主要病原。鱼诺卡氏菌全基因组生物信息学分析,发现了一个可能靶向定位于宿主细胞线粒体的分泌蛋白——动力蛋白调节蛋白robl/LC7。为了对鱼诺卡氏菌robl/LC7的亚细胞定位和功能进行初步研究,实验对鱼诺卡氏菌robl/LC7进行了基因克隆、真核表达重组质粒构建、分泌蛋白鉴定、亚细胞定位、过表达和凋亡检测。结果显示,成功克隆了鱼诺卡氏菌robl/LC7基因并构建了其真核表达质粒p EGFP-robl/LC7和pc DNA-robl/LC7;鱼诺卡氏菌分泌蛋白质谱鉴定证实robl/LC7为分泌蛋白;亚细胞定位研究显示robl/LC7-GFP融合蛋白呈全细胞分布,不与线粒体共定位;凋亡检测发现robl/LC7过表达能诱导FHM细胞凋亡。研究表明,鱼诺卡氏菌robl/LC7是一个不与线粒体共定位的分泌蛋白,其可能通过参与细胞凋亡调控,协助鱼诺卡氏菌在宿主体内生存和免疫逃避,并在鱼诺卡氏菌的致病过程中具有重要作用。