鳜鱼(Siniperca chuatsi)β-肌动蛋白基因cDNA全序列与5′侧翼区的克隆与分析

采用RT-PCR及RACE法,分离、克隆鳜鱼β-肌动蛋白基因cDNA全序列,再用基因组步行法(Genome Walker)克隆鳜鱼β-肌动蛋白基因5′调控区。序列分析结果表明,鳜鱼β-肌动蛋白基因全长1897bp,其中5′-UTR长94bp,3′-UTR长675bp,编码区长1128bp,编码375个氨基酸。将所得序列与其它动物类群的β-肌动蛋白基因序列进行比较分析显示,鱼类、两栖类、鸟类、哺乳类等不同类群脊椎动物β-肌动蛋白氨基酸序列同源性均在96%以上,说明该基因在生物进化过程中高度保守。通过鳜鱼与其它脊椎动物β-肌动蛋白基因的核苷酸序列构建的进化树显示,脊椎动物β-肌动蛋白聚类成3个分支,鱼类β-肌动蛋白基因形成一个独立的分化群,说明鱼类β-肌动蛋白基因起源于一个共同祖先。克隆得到的鳜鱼β-肌动蛋白基因5'侧翼序列长1399bp,对其进行序列分析,在其起始密码字ATG上游200bp范围内发现含有CAATbox、CC(A/T)6GG(CArGbox)、TATA box对转录调控起重要作用的顺式元件,同时在侧翼区也发现含有GC box、MYOD、YY1、SP1、GATA等多个潜在调控元件。鳜鱼β-肌动蛋白基因5′侧翼序列的克隆成功,为今后转基因鳜鱼的研究工作奠定了基础。

惠东港口海龟国家级自然保护区土壤理化性质

采用经典的土壤理化性质测定和滨海植被调查方法,对惠东港口海龟国家级自然保护区湿地表层土壤理化性质及其与植被相关性展开研究。结果表明:湿地的表层土壤质地主要是砂土。盐度、含水量、比重、容重以及孔隙度的变化范围分别是:0.13%~0.26%、1.61%~9.33%、1.46~2.84、1.14~1.57g·cm-3、1.00%~54.00%。p H均为7.00~7.50。有机质、有机碳、碱解氮、速效磷、速效钾、交换性钠的变化范围分别为1.60~22.93 g·kg^(-1)、0.88~13.30 g·kg^(-1)、13.80~155.70 mg·kg^(-1)、0.60~8.20 mg·kg^(-1)、1.17~12.24 mg·kg^(-1)和9.12~32.31 mg·kg^(-1)。表层土壤的盐度与交换性钠呈极显著的正相关性。比重与孔隙度呈极显著正相关性。容重与碱解氮、速效钾、有机质和有机碳呈现显著负相关性。同时有机碳与有机质、碱解氮和速效钾呈现极显著正相关性。有机质与碱解氮和速效钾呈现极显著正相关性。碱解氮与速效钾呈现极显著正相关性,而速效钾与交换性钠表现出显著正相关性。湿地植被的丰富度指数乔木层最高,草本层其次,灌木层最低。土壤有机质含量、有机碳含量与灌木层Shannon-Wiener多样性指数呈显著正相关。

2种稚海龟胃的组织形态及超微结构观察

对2种稚海龟的胃进行形态学观察显示:胃均呈J型,由贲门、胃体和幽门组成;胃体囊状,幽门管状;绿海龟稚龟胃体、幽门均较玳瑁稚龟的长;2种稚龟胃皱褶形态及分布不同。胃壁均由粘膜层、粘膜下层、肌层和桨膜组成,它们占2种稚龟胃壁的比例亦存在差异。粘膜上皮均为单层柱状上皮,无杯状细胞和微绒毛。绿海龟稚龟胃上皮细胞呈正六边形,其粘原颗粒呈扁椭圆形;玳瑁稚龟胃上皮细胞则呈不规则指突状,是绿海龟稚龟的2.3倍,其粘原颗粒呈球形且较绿海龟稚龟胃的大0.6倍。胃腺均呈直管状,可分为贲门腺、胃体腺和幽门腺,腺组成腺细胞皆无主细胞和壁细胞之分。绿海龟稚龟胃的粘膜下层、肌层及浆膜层均较玳瑁稚龟的发达。2种稚海龟胃的组织形态及结构的差异应与其食性高度相关。

玳瑁遗传多样性的RAPD分析

应用RAPD技术分析了玳瑁的遗传多样性。用20个随机引物对中国南海海域玳瑁7个个体的基因组DNA进行了PCR扩增,共扩增出1 351条DNA片段,平均每个个体扩增出193条条带。在检测到的193条条带中,多态性条带为69条,多态性条带百分比为35.8%,条带大小在200 bp～3 000 bp之间,7个个体间遗传距离为0.082 9～0.1813,平均遗传距离为0.132 7±0.029 9,表明中国南海海域玳瑁的遗传多样性水平较低,应加强该区域玳瑁种质资源的保护。采用类平均聚类法(NJTREE)构建了7个个体相互关系的分子聚类图,表明该7个玳瑁个体没有形成种群的分化。

太平洋丽龟的生理结构研究

目的研究太平洋丽龟的生理结构及特点,为我国开展海龟保育和科学研究提供参考。方法对1只误捕致死的太平洋丽龟进行解剖,观察其循环系统、消化系统、呼吸系统和泄殖系统并测量记录。结果太平洋丽龟心脏位于胸部正中、稍偏右;食管内壁分布许多锥状突起;小肠长240cm,占整个消化系统管道总长的53.1%,消化道总长与体长的比值(简称肠长比)为5.35;精巢1对,阴茎长30cm,可推断为成年的雄龟。结论太平洋丽龟的生理结构估计与其肉食性有关,这对开展人工驯养繁育和物种保护具有重要意义。

不同年龄绿海龟口腔的组织形态及超微结构比较

对不同年龄段绿海龟Chelonia mydas的口腔进行形态学观察。口腔均由喙、内鼻孔、舌、气门及咽喉腔组成。喙覆盖角质鞘,无牙齿。稚龟喙呈V型,无角质锯齿,下喙钩状;幼龟和成年龟喙呈U型,具多排角质锯齿,口裂均相对较稚龟小。上喙内侧角化内鼻孔2个;内鼻孔梳状乳突在稚龟中缺失,但在幼龟和成年龟中可见,且随年龄增长、增密。舌呈"U"型,短小;舌正后方有游离的半圆形膜状皱褶,其下方可见1个裂隙。气门紧随裂隙内侧,游离,由2个杓状软骨支撑。舌和气门下方舌骨1块;角腮骨1对,分别可伸至咽喉腔下方和头骨后方。咽喉腔约占口腔的1/2,表层分布有大量弧状皱褶,且左右各具1个咽鼓管孔。光镜下,口腔腔壁包含黏膜层、肌层和骨骼。黏膜层均由角化复层鳞状上皮和固有层构成,但仅稚龟舌后部的黏膜层可见分泌细胞分布。舌体与膜状皱褶之间有分支泡状腺;膜状皱褶下方的裂隙表面覆盖复层柱状上皮,可见管状腺分布;复层柱状上皮细胞和腺体细胞在ABPAS染色中均呈玫红色。肌层为骨骼肌,其在舌体分布较少,而在气门区域较发达。扫描电镜下,口腔黏膜上皮由多边形的角质细胞组成,其表面有不规则的波纹分布,微绒毛和杯状细胞均缺失。绿海龟口腔的组织形态及结构与其食性及生态适应紧密相关。

绿海龟源溶藻弧菌的分离鉴定及药敏分析

【目的】腐皮病是绿海龟(Chelonia mydas)龟苗培育中的常见病,传染性极强,发病率和死亡率高。为确定病因及治疗方法,从病龟鳍状肢的腐皮组织中分离病原菌。【方法】从症状明显的稚龟四肢病灶中分离纯化得到疑似病原菌,编号CMRT91026,开展形态特征、生理生化特性、16SrRNA鉴定和系统发育树构建及相关药物敏感试验。【结果】该菌能在TCBS培养基上生长,菌落呈黄色,为革兰氏阴性短杆菌;在1%NaCl葡萄糖磷酸盐胨水、蔗糖、甘露糖和赖氨酸脱羧酶上的生化特性均显示阳性,并且在3%~10%NaCl胨水均能生长;与NCBI上的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)同源性达100%。药敏结果显示,该菌对恩诺沙星、萘啶酸、左氧氟沙星、米诺环素、头孢吡肟和头孢曲松敏感;对多西环素、氟苯尼考、妥布霉素、大观霉素、诺氟沙星和氨曲南呈中介;对新霉素、复方新诺明、阿莫西林、庆大霉素、丁胺卡那霉素等15种药物有耐药性。【结论】该菌株鉴定为溶藻弧菌,对喹诺酮类药物(如恩诺沙星)、四环素类药物(如米诺环素)及头孢类(如头孢曲松)等药物较为敏感。试验结果为绿海龟稚龟溶藻弧菌病的诊断及病害防控提供了一定参考。

分子遗传标记技术在海龟研究中的应用

分子遗传标记是随着分子生物学技术的飞速发展而出现的遗传学标记技术,它突破了以往形态标记、细胞学标记和蛋白质标记等表达型标记的局限性,因其所具有的高效性和可靠性而广泛应用于物种的遗传变异性研究领域。本文对限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态DNA(RAPD)、微卫星DNA(SSR)以及线粒体DNA(mtDNA)序列多态性等常用的分子标记技术在海龟遗传多样性、繁殖生物学、种质资源鉴定和亲缘地理学以及进化研究中的应用作了简单介绍。

惠东海龟湾水质生态学评价与微生物群落结构特征

惠东港口海龟国家级自然保护区是中国大陆仅存的海龟繁殖栖息地,监测其水体质量及微生物群落对于保护区日常管理和维护区域生态环境具有重要意义。根据地形分布特点,设置14个采样点对该保护区水域水质进行评价,同时采用高通量测序技术对微生物群落组成(细菌、真菌、微型真核生物)进行调查。结果表明:海龟湾水质定性评价为优,营养状态为贫营养。海龟湾海域微生物种类丰富,细菌分布于14门66科96属,变形菌门(Proteobacteria)(82.2%)为优势类群,其次是拟杆菌门(Bacteroidetes)(6.6%);真菌分布于3门16科22属,优势类群为子囊菌门(Ascomycota)(98.5%);微型真核生物群落主要由节肢动物门(Arthropoda)(59.9%)和顶复亚门(Apicomplexa)(16.5%)组成。比较两对微型真核生物引物扩增效果,发现物种组成差异显著,需同时使用才能客观反应海龟湾水域微型真核生物多样性。本研究为保护研究区域海洋生态系统健康提供科学依据。

绿海龟稚龟性别鉴定及临界温度

通过组织形态学鉴定、羊水和血液中性激素测定等手段,对惠东港口海龟保护区不同恒温下孵化的绿海龟(Chelonia mydas)进行研究,寻求绿海龟稚龟性别鉴定的最佳方法。结果显示,(1)组织形态学,绿海龟性腺切片分皮层和髓质两部分,卵巢的皮层较厚、基质中有大小不一的未成熟卵细胞,髓质中空腔较少;睾丸的皮层较薄,髓质中空腔较多,呈现出显著的被基质包围的髓质索。(2)性激素测定,当雌二醇与睾酮含量之比E2∶T<1.5时,孵出的稚龟为雄性(♂);当E2∶T>1.5时,为雌性(♀)。(3)绿海龟性别决定的临界温度在29.4～29.5℃之间,此时孵出稚龟的性比约为1∶1。本文还讨论了各种不同性别鉴定方法的优劣和时期选择。

惠东幼年绿海龟的洄游规律及觅食地选择

绿海龟(Chelonia mydas)为全球性濒危物种、我国Ⅰ级重点保护野生动物。栖息地保护是野生绿海龟保护的一种极为重要和有效的保护策略,但我国幼年绿海龟的生活习性及其栖息地分布尚不明确,故开展相关洄游行为及栖息地分布研究意义重大。2011至2015年间,将6只来自广东惠东海龟国家级自然保护区人工培育2~14 a的幼年绿海龟,分为夏季组(n=3)及冬季组(n=3),在其背甲上安装追踪器。其中,2只个体分别安装了美国Wildlife Computers公司生产的追踪器SPOT5-AM-S181C和SPOT5-AM-S244A,另外4只个体安装美国Telonics公司生产的TAM-2639追踪器,然后在出生地放归。利用全球ARGOS系统实施全天候的追踪监测,地理坐标数据的筛选及分析在卫星追踪分析工具软件(STAT)上完成。6只个体4年共获得有效位点397个,其中,包括前期研究获得的有效位点62个。相关有效位点输入免费软件Maptool,通过GIS图层叠加、汇总生成洄游路线图。研究结果用以揭示我国幼年绿海龟的洄游规律。使用SPSS软件t-检验统计冬夏两组海龟间的个体大小及洄游速度是否存在统计学差异。冬季组、夏季组绿海龟的背甲曲线长(CCL)分别为(48.9±8.65)cm和(59.07±7.64)cm,组间无显著性差异(t=1.527,df=4,P=0.202)。追踪期平均(66±47)d,追踪路程(1653±1585)km(n=6)。平均最小洄游速度,夏季组为(1.63±0.22)km/h(n=3),冬季组为(0.67±0.12)km/h(n=3),夏季组明显较冬季组高(t=6.726,df=4,P=0.003);夏季及冬季分别游往台湾和海南两个方向,主要沿大陆架140 m等深线以内海域洄游,所有个体的洄游路线及方向均与同期海流大致相同,活动范围与近海渔场及开发区域高度重叠,与早期野外调查结果一致。仅冬季组观察到定居及归巢行为,越冬场分布在越南昏果岛及我国海南岛东部;越夏场则分布在福建至浙江一带,主要分布在近岸或近岛20 m等深线以内浅海,为底栖大型海藻、海草床或珊瑚礁的集中分布区。研究结果揭示,惠东人工培育幼年绿海龟放归后可正常洄游、觅食和适应野外环境,在东海、南海之间作季节性定向洄游的趋势十分明显,觅食地沿我国大陆架沿岸及附属海岛分布,进一步印证了我国近海绿海龟洄游廊道的存在。建议把北部湾、琼州海峡、海南东部、广东、福建、浙江及台湾沿岸及附属岛屿的海洋保护地整合优化,制订国家海龟栖息地名录,组建海洋类型国家公园保护网络,同时深入开展国际及地区间的保护合作,加强绿海龟及其觅食地和洄游廊道这些重要栖息地保护,使海龟整个生命周期得到有效和完整的保护。