带有HPV-16 E6/E7基因的DC疫苗抑制裸鼠宫颈癌生长的机制

目的观察由携带HPV-16 E6/E7基因的树突细胞(dendritic cell,DC)疫苗免疫得到的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)在裸鼠体内对宫颈癌的抑制作用及相关机制。方法诱导培养C57BL/6小鼠骨髓的未成熟DC(imDC),将已经成功构建的携带人乳头状瘤病毒(HPV)-16 E6/E7基因的重组腺病毒感染imDC,Western印迹检测E7蛋白的表达;构建裸鼠宫颈癌细胞移植瘤模型,应用DC疫苗诱导的CTL处理后,观察裸鼠肿瘤的体积变化;CCK8(cell counting kit8)法检测经DC疫苗免疫的BALB/c小鼠脾脏T淋巴细胞的增殖;免疫组化法检测裸鼠脾脏组织CD4+T淋巴细胞的表达。结果成功培养出DC并制备出DC疫苗;第28天各组裸鼠肿瘤体积pAd-E6E7-DC-CTL-CaSki组与对照组pAd-mock-DC-CTL-CaSki组、DC-CTL-CaSki组、CaSki组相比较,pAd-E6E7-DC-CTL-CaSki组裸鼠肿瘤体积最小(P<0.05);CCK8法检测经DC疫苗免疫的BALB/c小鼠脾脏T淋巴细胞的增殖,结果 pAd-E6/E7-DC组淋巴细胞OD值明显高于pAd-mock-DC组、DC组和PBS组(P<0.01);免疫组化检测各组裸鼠脾脏组织CD4 T淋巴细胞的表达结果显示,pAd-E6E7-DC-CTL-CaSki组CD4表达量最高,pAd-mock-DC-CTL-CaSki组和DC-CTL-CaSki组CD4表达量次之,CaSki组CD4表达量最低。结论带有HPV-16 E6/E7基因修饰的DC疫苗,能够促进小鼠体内T淋巴细胞的增殖,诱导CTL抑制裸鼠宫颈癌移植瘤的生长。

带有HPV-16 E6/E7基因的树突状细胞疫苗对裸鼠人宫颈癌CaSki细胞移植瘤的抗肿瘤作用

目的:探索带有HPV-16 E6/E7基因的树突状细胞(dendritic cell,DC)疫苗对裸鼠人宫颈癌CaSki细胞移植瘤的抗肿瘤作用。方法:体外诱导培养C57BL/6小鼠骨髓的未成熟DC(immature DC,imDC),将已经成功构建的携带人乳头状瘤病毒(human papillomavirus,HPV)-16 E6/E7基因的重组腺病毒感染imDC,Western blot检测E7蛋白的表达;构建裸鼠的人宫颈癌CaSki细胞移植瘤模型,应用DC疫苗诱导的BALB/c小鼠脾脏的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)处理后,观察裸鼠肿瘤体积变化,肿瘤长出第28天后处死裸鼠,小心剥下肿瘤组织,石蜡包埋,HE染色观察各组肿瘤的细胞形态,免疫组织化学技术法检测肿瘤组织中Bcl-2、Bax蛋白的表达情况。结果:成功培养出DC并制备出DC疫苗;第28天各组裸鼠肿瘤体积pAd-E6/E7-DC-CTL-CaSki组与pAd-mock-DC-CTL-CaSki组、DC-CTL-CaSki组、CaSki组相比较,pAd-E6/E7-DC-CTL-CaSki组裸鼠肿瘤体积最小(P<0.05);免疫组化检测肿瘤组织中Bax蛋白的表达结果显示pAd-E6/E7-DC-CTL-CaSki组最高,而CaSki组表达最低;免疫组化检测肿瘤组织中Bcl-2蛋白的表达结果显示pAd-E6/E7-DC-CTL-CaSki组最低,而CaSki组表达最高。结论:带有HPV-16 E6/E7DC疫苗能够诱导CTL抑制裸鼠人宫颈癌CaSki细胞移植瘤的生长。

HPV 16 E6E7基因修饰树突状细胞疫苗诱导CTL致CaSki细胞凋亡体外实验研究

目的:采用人乳头状瘤-16(HPV-16)E6E7重组腺病毒(pAd-E6E7)转染树突状细胞(Dendritic cell,DC),观察基因修饰的DC疫苗诱导细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic Tlymphocyte,CTL)致使CaSki细胞凋亡的效果。方法:将pAd-E6E7转染体外培养的小鼠未成熟树突状细胞制备DC疫苗,激光共聚焦显微镜观察转染的小鼠未成熟树突状细胞绿色荧光蛋白表达,流式细胞术检测转染前后小鼠树突状细胞表面标志物(CD40、CD86、MHCⅡ和CD11C)。DC疫苗诱导产生特异性细胞毒性T淋巴细胞,与CaSki细胞共培养后,采用DAPI、TUNEL及流式细胞术检测CaSki细胞凋亡情况。结果:pAd-E6E7成功转染体外培养的小鼠未成熟树突状细胞,体外转染效率约为40%～50%,成功制备了HPV16 E6E7基因修饰树突状细胞疫苗,诱导产生细胞毒性T淋巴细胞,经DAPI、TUNEL及流式细胞术检测证明CaSki出现凋亡。结论:以带有HPV16 E6E7基因的重组腺病毒载体转染DC制备基因修饰的DC疫苗,诱导CTL致使CaSki细胞出现凋亡。

小鼠骨髓来源未成熟树突状细胞蛋白表达的分析

目的利用双向电泳和质谱技术对小鼠骨髓来源未成熟树突状细胞(dendritic cells,DC)表达的蛋白质进行分析。方法 IL-4和GM-CSF诱导未成熟DC的分化,提取细胞总蛋白,定量。双向凝胶电泳分离蛋白质组分,胶体银染显色,PDQuest进行图像分析后选取蛋白点,胶内酶解后MALDI-TOF MS进行肽指纹图谱鉴定,MS-Fit分析质谱数据。结果细胞生长情况和表面标志物检测表明获得了高纯度的未成熟DC。图像分析结果显示,DC中检测到了(660±10)个蛋白点,主要分布在相对分子质量28×103～100×103,等电点5.0～9.0之间。鉴定了87个蛋白点,其中与未成熟DC免疫调节功能相关的蛋白质有40个(45.98%);与大分子代谢相关的有37个(42.53%)。结论成功分离到了约660个小鼠骨髓来源未成熟DC表达的蛋白质,鉴定出了其中87个蛋白。

mIL-21-hIgGFc融合蛋白在293E细胞中的表达纯化及其对CD8^+T细胞表型的影响

目的:在293E细胞中表达小鼠IL-21-hIgGFc融合蛋白,并检测该蛋白对CD8+T细胞表型的影响。方法:运用RT-PCR方法从BALB/c小鼠脾脏淋巴细胞扩增出IL-21基因,插入到PTT3-hIgGFc载体上,获得重组质粒PTT3-mIL-21-hIgGFc;用磷酸钙瞬时转染293E细胞,48 h和72 h后分别收集培养上清。培养上清经MOLLIPORE LabscaleTMTFF system浓缩后,Protein G琼脂糖柱纯化获得mIL-21-hIgGFc融合蛋白,再用ELISA和SDS-PAGE电泳检测融合蛋白的含量和纯度。mIL-21-hIgGFc刺激P1A小鼠的CD8+T细胞,72 h后,运用流式细胞术检测其表型改变情况。结果:重组质粒PTT3-mIL-21-hIgGFc经酶切和测序确定载体构建成功,ELISA检测表明293E细胞上清中含有787 ng/ml,SDS-PAGE结果显示得到了较纯的融合蛋白,纯化后获得500μg融合蛋白mIL-21-hIgGFc。融合蛋白mIL-21-hIgGFc处理P1A小鼠CD8+T细胞后,CD44lowCD62Lhi CD8+T细胞明显增多。结论:我们成功构建了PTT3-mIL21-hIgGFc重组质粒,在293E细胞中表达并纯化出mIL21-hIgGFc融合蛋白。mIL21-hIgGFc能促进CD8+T细胞向CD44lowCD62LhiCD8+记忆干细胞表型分化,这对于肿瘤过继免疫治疗方案的改进具有重要的参考意义。

树突状细胞疫苗的制备及其体外诱导细胞毒性T淋巴细胞对宫颈癌CaSki细胞的杀伤作用

目的:制备树突状细胞(dendritic cells,DCs)疫苗并观察其在体外诱导细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTLs)对宫颈癌CaSki细胞的杀伤效应。方法:分离培养小鼠未成熟DCs,FCM检测小鼠未成熟DCs表面标志物CD40、CD86、主要组织相容性复合体-Ⅱ(major histocompatibility complex-Ⅱ,MHC-Ⅱ)和CD11c;将已成功构建的携带人乳头状瘤病毒(human papillomavirus,HPV)16E6E7基因的重组腺病毒pAd-E6E7感染体外培养的小鼠未成熟DCs,提取CaSki细胞裂解物负载DCs,制备DC疫苗,激光共聚焦显微镜下观察pAd-E6E7感染的小鼠未成熟DCs绿色荧光蛋白表达,Western印迹法检测E6蛋白的表达;DCs疫苗诱导产生CTLs后与CaSki细胞共培养,CCK8(cell countingkit8)法检测其对CaSki细胞的杀伤效应。结果:成功分离培养了小鼠未成熟DCs,并制备获得了HPV16E6E7特异性DCs疫苗。DCs疫苗诱导产生的CTLs对CaSki细胞具有杀伤作用,pAd-E6E7感染组对CaSki的杀伤效应明显高于CaSki细胞裂解物负载组及未处理DCs组(P<0.05)。结论:以携带HPV16E6E7基因的重组腺病毒感染DCs制备基因修饰的DCs疫苗,具有诱导CTLs体外杀伤子宫颈癌CaSki细胞的作用。