犬细小病毒VP2基因的克隆与生物信息学分析

本研究旨在克隆犬细小病毒VP2(Canine parvovirus VP2,CPV-VP2)基因,构建克隆载体pMD18-T-VP2,分析其生物信息学特征。以犬细小病毒(CPV)阳性病犬血液基因组病毒DNA为模板,PCR扩增CPV-VP2基因,通过TA克隆获得pMD18-T-VP2重组质粒,测序后对其进行生物信息学分析。结果表明:(1)CPV-VP2完整的开放阅读框由1755个核苷酸组成,共编码585个氨基酸残基,其序列同源性与浣熊最高,达97.6%;(2)信号肽在线预测认为,CPV-VP2基因无信号肽;(3)CPV-VP2大多数氨基酸偏好以T、A结尾的密码子;(4)CPV-VP2蛋白可能存在7个糖基化位点,其丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸分别存在8个、10个和7个磷酸化位点;(5)CPV-VP2可能存在76个B细胞抗原表位;(6)CPV-VP2蛋白为亲水性蛋白,无跨膜结构;(7)CPV-VP2蛋白二级结构的α-螺旋区域占9.93%、β-折叠区域占24.49%、无规则卷曲区域占65.58%;(8)CPV-VP2蛋白三级结构存在多个螺旋和折叠区域,主要以无规则卷曲为主。本研究为制定CPV-VP2基因原核或真核高效表达策略提供了参考资料,并为进一步制备CPV胶体金快速诊断试纸条和基因工程疫苗奠定了基础。

山羊Klf4基因克隆、原核表达和His-Klf4融合蛋白纯化

旨在克隆山羊Klf4基因,构建重组质粒pET30a-Klf4,通过原核表达技术获得纯化的His-Klf4融合蛋白。从山羊的生殖脊中提取总RNA,用RT-PCR的方法扩增Klf4基因编码区序列,通过TA克隆构建pMD18-T-Klf4重组质粒。酶切鉴定与测序分析后将Klf4的cDNA亚克隆至pET-30a载体,构建重组质粒pET30a-Klf4。酶切鉴定后将其导入大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting检测确认,镍离子金属螯合亲和层析法纯化His-Klf4融合蛋白。结果表明:(1)从山羊生殖脊中克隆了Klf4基因,其开放阅读框由1 434个核苷酸组成,编码478个氨基酸,而且该序列与绵羊的同源性最高,达到98.5%;(2)经过SignalP 4.0在线分析,Klf4的编码蛋白不存在信号肽;(3)经SDS-PAGE和Western blotting分析表明,重组质粒pET30a-Klf4在大肠杆菌中得以表达;在变性条件下纯化,获得了His-Klf4融合蛋白。

黎药经验方的致突变试验研究

目的:考察黎药经验方的遗传毒性。方法:致突变试验采用鼠伤寒沙门菌回复突变试验(Ames试验)、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验和小鼠精子畸型试验等三项试验。Ames试验:设受试物5个剂量组(即5.000、1.000、0.200、0.040、0.008mg/皿),另设未处理对照组、溶剂对照组和阳性对照组;微核试验:小鼠50只,雌雄各半,设10、5.0、2.5 g/kg·bw剂量组,另设溶剂对照和阳性对照组;精子畸型率试验:昆明种小鼠雄性25只,分组同微核实验,检测精子畸形率。结果:Ames试验中,加或不加S9的情况下,受试物对TA97、TA98、TA100和TA102菌株均未显示致突变作用。与溶剂对照组比较,高、中、低3个剂量的受试物组雄性、雌性小鼠微核试验、小鼠精子畸变率差异无统计学意义(P>0.05)。结论:综合考虑前期试验结果及相关研究,在本次实验条件下,在一定剂量范围内,Ames试验、微核试验和小鼠精子畸变试验结果显示阴性,认为该黎药经验方具有遗传毒性的可能性较小。

探讨热原试验中影响试验数据的因素

目的通过几组试验,分析热原试验中存在常见影响试验数据的几个要素,并提出解决建议。方法对供试品、预选周期、基础体温、家兔的休息周期等多个方面进行统计,总结影响热原数据变化因素。结果家兔升温总和均值随着连续注射批次的增加而有所降低,体温灵敏度变差;合格家兔在4周以内再次预选,合格比例85%以上,6周符合要求的比例为79.1%,9周合格比例降至66.6%;基础体温38.0~38.4℃及39.3~39.6℃区间家兔实验中体温波动幅度≥0.6℃的动物例数较多,38.0~38.4℃区间家兔降温〈0℃动物数达到50.0%,39.3~39.6℃区间家兔最大升温≥0.4℃的动物数比例较高;家兔冬季基础体温略低于夏季（约0.2℃）,休息72~96 h后对家兔基础体温均值、异常体温动物的数量有较好的控制。结论热原检查应尽量采用不同品种供试品交替试验,并通过控制预选兔的使用周期及合理安排家兔实验休息周期,选择基础体温适中的家兔进行试验,以保证热原试验数据的准确性。

卵巢上皮癌裸鼠原位移植瘤及人卵巢上皮癌卵巢内肿瘤浸润类型分析

目的探讨人卵巢上皮癌实体瘤组织片和人卵巢上皮癌细胞株OVCAR-3来源的裸鼠原位移植瘤模型的卵巢内肿瘤浸润类型,以及人卵巢上皮癌卵巢内肿瘤浸润类型的特点。方法将人卵巢上皮癌实体瘤组织片和人卵巢上皮癌细胞株OVCAR-3皮下移植获取瘤源,再分别植入裸鼠单侧卵巢包膜内制备裸鼠原位移植瘤模型。观察两种方法制备的肿瘤模型卵巢内的浸润类型。同时通过病理检查分析了54例国际妇产科联盟(FIGO)Ⅰ~Ⅱ期人卵巢上皮性癌的肿瘤浸润类型。结果肿瘤在卵巢内浸润类型大致分为三类:假包膜型、假包膜浸润型和假包膜穿透型。实体瘤组假包膜型发生率(18.2%)低于细胞株组(42.3%,P<0.05),而实体瘤组假包膜穿透型发生率(50.0%)高于细胞株组(23.1%,P<0.05),两组间的假包膜浸润型差异无统计学意义(P>0.05)。肿瘤在卵巢内浸润类型随着种植时间而发生变化,种植初期假包膜型比例较高,随着种植时间的延长,假包膜穿透型比例增加。人卵巢上皮癌卵巢内浸润类型中,Ⅰ期假包膜型比例较高(P<0.05),而Ⅱ期包膜穿透型比例较高(P<0.05)。两种病理类型之间其肿瘤生长类型的比例差异无统计学意义(P>0.05)。结论人卵巢上皮癌实体瘤组织片和人卵巢上皮癌细胞株OVCAR-3制备裸鼠原位移植瘤模型有差别;相对于实体瘤组织片模型,细胞株模型更稳定,更适合后续研究。三种肿瘤卵巢内浸润类型在移植瘤种植8周时比例比较均衡,8周是后续实验最佳切入时机。