定安县野生青蛙曼氏裂头蚴感染情况的初步调查

目的：了解海南省定安县野生青蛙体内曼氏裂头蚴的自然感染情况,分析当地人群感染曼氏裂头蚴的潜在风险。方法：2014年7-12月在海南省定安县当地农村的池塘、河流和农田采集野生青蛙,称完体重后,剖检曼氏裂头蚴,记录其寄生的部位和感染数量,并进行统计学分析。结果：共采集野生青蛙153只,其中感染曼氏裂头蚴的青蛙31只,自然感染率为21%（31/153）,总共发现曼氏裂头蚴141条,平均感染强度为4.6条/只,7月份采集的青蛙感染率最高。曼氏裂头蚴寄生部位以青蛙后腿为主,蛙体的感染与其体重大小关系不大。结论：定安县野生青蛙感染曼氏裂头蚴的情况较为普遍,且对人群有潜在的威胁,应对曼氏裂头蚴病的防控采取相应的措施。

细粒棘球绦虫14-3-3zeta蛋白的生物信息学分析

目的应用生物信息学技术对细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)14-3-3zeta蛋白的结构和功能进行预测和分析,为进一步的实验研究提供依据。方法利用美国国家生物技术信息中心(NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统(ExPASY,http://expasy.org/)提供的各种有关基因和蛋白序列、结构信息分析的工具,并结合其它生物信息学分析软件,对该蛋白质的结构和功能进行预测和分析。结果该基因全长为771 bp,编码256个氨基酸,其编码的蛋白相对分子量理论预测值和等电点分别是29.4 kDa和5.04。预测该蛋白无信号肽和跨膜区,二级结构含8个α-螺旋和12个β-折叠股,氨基酸序列中有9个潜在抗原表位。结论初步认识了细粒棘球绦虫14.3-3zeta蛋白的基本特征,为深入研究该蛋白的生物学功能奠定了基础。

广西医科大学在校大学生人芽囊原虫感染情况调查

目的:了解广西医科大学在校大学生人芽囊原虫(Blastocystis hominis,B.h)的感染情况。方法:应用酸醚离心沉淀法粪检,抽查3个年级共1 433人,统计分析民族、性别、生源地、不同年级组别之间B.h感染率。结果:广西医科大学在校大学生B.h平均感染率为14.93%;汉族感染率13.48%,壮族感染率18.38%,其他民族感染率为17.24%。各年级感染率最低为13.19%,最高达16.28%。男性感染率为14.74%;女性感染率为15.06%。广西本地生源感染率为15.06%;外地生源感染率为13.94%。结论:广西医科大学在校大学生B.h感染率较高,并且存在校内感染的可能性。壮族学生B.h感染率高于汉族。

曼氏迭宫绦虫四次跨膜蛋白(SmTSP)的生物信息学分析

目的:通过对曼氏迭宫绦虫的4次跨膜蛋白(SmTSP)潜在的生物学特征和参数进行分析,从而获得其具有的潜在生物学功能和应用价值。方法:利用美国国家生物技术信息中心(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统(http://www.expasy.org/)提供的在线分析工具对编码蛋白的氨基酸序列的理化性质,跨膜结构和三维空间结构进行分析,同时利用Vector NTI suite和TreeView software生物信息分析软件进行编码氨基酸序列的相似性比对和进化树分析,利用CBS Prediction Servers BepiPred进行最大胞外环(LEL)的B细胞线性表位预测。结果:从文库中得到的SmTSP是全长基因,编码的蛋白是24.8kDa,理论等点为7.88,是一个稳定的蛋白分子。编码该蛋白的氨基酸序列共有4个跨膜区,分别是TM1aa16~38、TM2aa58~80、TM3aa87~109、TM4aa200~222。LEL中含有CCG结构、PXSC结构、GC结构和含有9个二聚体结合位点的保守特征结构。SmTSP全长序列与多房棘球绦虫、细粒棘球绦虫的相似性均能达到72%,但是与吸虫之间的相似性仅达到31%~59%,然而与人类相似性仅有23%,与小鼠的相似性最低,仅有17%。在进化树分析中,SmTSP与绦虫的亲源性在对比序列中是最近的,吸虫类次之,但是与埃及裂体吸虫和牛裂体吸虫、其他寄生虫(美洲钩虫和秀丽隐杆线虫)的亲源性相对较远,与哺乳动物亲源性最远。LEL有3个B细胞表位,分别是13aa^21aa、41aa^63aa和70aa^76aa。此外与人类四次跨膜蛋白的LEL中B细胞表位数量、分布的位置和编码的氨基酸都不同。结论:SmTSP可能是一个定位于虫体表膜并且具有应用前景的疫苗候选分子。

浅析翻译控制肿瘤蛋白生理功能的研究近况

翻译控制肿瘤蛋白（TCTP）为肿瘤研究常涉及的一类高表达类蛋白质，又称P21、P23、Q23、组胺释放因子和Fortilin，同源性、保守性都很高，广泛存在于真核生物中。此类蛋白具有逆转肿瘤、调节细胞分化增殖、参与应急反应、对抗细胞凋亡、抑制炎症反应的功能，还与糖尿病、真菌感染、寄生虫病的产生发展相关。本文结合近年来国内外关于翻译控制肿瘤蛋白功能的研究报道资料，对TCTP功能的研究进行了综述。

HBV基因型在我国九省市的分布及与临床指标的关系

目的用反向斑点杂交检测HBV基因型的方法 ,了解我国HBV基因型的分布及其临床意义。方法利用反向斑点杂交对我国云南、江苏、浙江、新疆、北京、辽宁、福建、湖南、广东等9个省市的HBV阳性患者血清,和广州地区的肝癌患者术前血清进行HBV基因分型,并结合其临床指标进行相关性分析。结果 706例被分型的标本中,A型占0.1%(1/706)、B型占46.2%(326/706)、C型占49.0%(346/706)、D型占1.6%(11/706)、混合感染占3.1%(22/706)。HBV基因型与患者的年龄、性别、e抗体、e抗原差异没有统计学意义;肝癌患者的HBV基因型与肿瘤包膜、病灶数量、肝炎史、浸润、血管侵入、转移、临床分期、肿瘤家族史、饮酒史以及一些生化指标等差异也没有统计学意义。但发现了HBV基因型与病毒载量之间的关联具有统计学意义(P<0.01)。结论我国HBV基因型以B、C型为主,两者之间的感染人数差别不明显。我国还有少量D型分布,更少量的A型。HBV基因型与HBV病毒载量之间的关联具有统计学意义(P<0.01),提示HBV基因型可能影响患者体内HBV的复制。

曼氏迭宫绦虫钙/钙调素依赖蛋白激酶I(SmCaMK I)基因的生物信息学分析与表达鉴定

目的开展SmCaMK I(曼氏迭宫绦虫钙/钙调素依赖蛋白激酶I)的潜在生物学特征分析和功能研究。方法利用相关网站和软件对SmCaMK I的同源性核苷酸序列比对分析、保守位点预测、构建分子进化树、编码氨基酸的淋巴细胞表位进行分析预测。此外,SmCaMK I进行扩增,并克隆到表达载体pET-28α(+)中进行蛋白的表达纯化,制备大鼠免疫血清进行虫体免疫组织定位分析。结果 SmCaMK I是一个全长基因,由1 068bp组成,编码355个氨基酸。SmCaMK I与细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫的CaMK I保守功能域的氨基酸序列一致性分别为89%和88%,与人的CaMK I氨基酸序列一致性仅仅只有44%。分子进化树分析中SmCaMK I与绦虫属的亲缘关系最近,与其他物种亲缘性较远。与人类CaMK I相比,淋巴细胞表位具有统计学差异。SmCaMK I能够定位在成虫的睾丸和虫卵,在裂头蚴中大量表达和特异定位于体表。结论SmCaMK I是参与虫体生长发育繁殖的重要蛋白分子,还可能是一个潜在的疫苗靶标蛋白。

人芽囊原虫在IMDM单相培养基中的体外培养效果观察

目的观察IMDM（Iscove＇s Modified Dulbecco＇s Medium）单相培养基对人芽囊原虫（Blastocystis hominis,B.h）的体外培养情况。方法采用IMDM单相培养基对B.h进行体外连续培养,比较不同pH值、血清浓度及接种量等条件下虫体生长繁殖情况及影响因素。结果 B.h在IMDM培养基中最适培养条件为：pH值7.0-8.0;新生牛血清含量大于10%;接种量不小于1×105个原虫/管;青、链霉素1万单位/mL,于37℃条件下厌氧培养,每3-6天转种1次,可以达到长期培养效果。结论 IMDM单相培养基更适合B.h的生长繁殖,可以用于诊断及体外长期培养。

曼氏迭宫绦虫annexinB8的生物信息学分析和基因克隆

目的通过生物信息学预测曼氏迭宫绦虫annexinB8(SmannexinB8)的生物学特征,及潜在功能和结构,并且进行基因克隆,为下一步SmannexinB8参与宿主免疫调节研究提供依据。方法通过NCBI的ORF finder工具对SmannexinB8的开放阅读框进行分析.利用ExPASy网站进行蛋白的物理化学参数、信号肽、跨膜螺旋、潜在分子生物学功能的预测,通过NCBI/BLAST。对蛋白保守功能域进行检测。不同物种的annexin序列从NCBI网站获取,并利用Vector NTI suit 8.0和TreeView软件进行分析。利用SWISS-MODEL网站和SPDBV 4.10软件分析SmannexinB8蛋白的三维空间结构。此外。对SmannexinB8基因进行扩增,并克隆到原核表达载体pET-28a(+)。结果 SmannexinB8是一个全长基因,编码347个氨基酸。蛋白由4个典型的annexin重复结构域组成,序列当中没有信号肽,是一个稳定的可溶性蛋白分子。三维空间立体结构分析结果显示SmannexinB8是一个保守的蛋白。SmannexinB8与多房棘球绦虫、口膜壳绦虫、细粒棘球绦虫、华支睾吸虫以及人类的annexin基因的同源性分别是68%,67%。65%,46%和40%。分子进化分析显示SmannexinB8与绦虫属的亲源性最近,而与其他物种,如吸虫、哺乳动物亲源性较远。结论 SmannexinB8可能具有抑制磷脂酶A2的活性,促进细胞融合、参与调节免疫反应和离子通道形成的功能,可能在参与宿主免疫调节中起到关键性的作用。

一种基于液相基因芯片技术对甲型和乙型流感病毒分型检测方法的建立

目的建立能够对甲型流感病毒(influenza virus A,INFA)和乙型流感病毒(influenza virus B,INFB)进行区分的液相基因芯片技术,为甲型和乙型流感病毒的分型提供一种高通量、高灵敏度的检测和鉴定方法。方法从NCBI的Gen Bank下载具有代表性的流感病毒基因组序列,利用生物信息学软件Bio Edit进行序列比对,分别设计针对INFA和INFB的简并引物和特异性探针,将设计好的引物和探针与Gen Bank中所有的基因序列进行比对,以验证其特异性。经探针合成、悬浮液相芯片制备和检测条件的优化获得用于甲型和乙型流感病毒分型的液相基因芯片。结果所检测INFA和INFB均可获得特异性杂交信号,非特异性杂交信号不明显,将2种病毒混合,模拟混合病毒感染也可以得到相应的特异性杂交信号。灵敏度评估结果表明INFA的检测灵敏度为1~10空斑形成单位(plaque forming unit,pfu),而INFB为10~100 pfu。将本方法用于检测11份临床样本,其结果与荧光定量分型逆转录聚合酶链反应(reverse transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测方法的结果一致。结论本研究初步建立了INFA和INFB的液相基因芯片检测技术,可用于流感病毒的初步筛查和鉴定,并且可以进行混合感染样本的检测,为流感病毒的分型和鉴定提供了一种新的手段。

反向斑点杂交技术检测HBV基因型方法的评价

目的评价用于检测乙型肝炎病毒(HBV)基因型的反向斑点杂交(RDB)方法。方法应用RDB检测723例HBV阳性标本的HBV基因型。其中对423例HBV序列测序结果清晰可读的样本进一步使用NCBI在线数据库分析、系统进化法分析其HBV基因型,并与RDB法结果进行比较。将样本HBV序列与所用的探针序列进行比对,以评价单个碱基突变对该方法的影响。结果 RDB法检测的检出率为97.6%。RDB检测结果与NCBI在线数据库分析法的一致性为98.8%;与系统进化分析法一致性为100%。与对应探针有1个碱基差异的HBV A型1例、B型12例、C型46例和D型1例均被成功检出。结论 RDB是一种灵敏、准确、有效,且具有很高临床应用价值的HBV基因型检测方法。单碱基的突变不会影响其对HBV的分型结果。

曼氏迭宫绦虫中亮氨酸氨基肽酶基因的生物信息学分析和转录水平检测

目的检测曼氏迭宫绦虫的3个亮氨酸氨基肽酶亚类(leucine aminopeptidases of Spirometra mansoni,Sm LAPs)基因在虫体不同发育阶段的转录水平,为进一步病原诊断研究奠定基础。方法运用生物信息学相关软件对3个亮氨酸氨基肽酶亚类编码蛋白的氨基酸序列的功能区域、免疫学特征、信号肽和跨膜区预测分析。应用Real time PCR方法检测Sm LAPs在曼氏迭宫绦虫的成节、孕节和裂头蚴阶段的转录水平。结果对Sm LAPs编码氨基酸序列的保守区域进行比对,Sm LAPa与Sm LAPb、Sm LAPc的氨基酸序列一致性均为38%,Sm LAPb和Sm LAPc的一致性也只有44%。多功能位点分析发现,Sm LAPs均含有底物结合位点、锌离子结合位点和多肽结合位点。在B细胞线性表位预测结果显示,Sm LAPa有13个、Sm LAPb有14个、Sm LAPc有13个。T细胞表位预测中,Sm LAPa有12个、Sm LAPb有13个、Sm LAPc有14个。3个Sm LAPs亚类序列中均含有一个强烈的信号肽,并且均没有跨膜区域。在虫体各个发育阶段的转录水平检测中,在成节阶段,Sm LAPb的转录水平是Sm LAPa的1.34倍,Sm LAPc的转录水平是Sm LAPa的46.53倍。在孕节阶段,Sm LAPb的转录水平是Sm LAPa的1.96倍,Sm LAPc的转录水平是Sm LAPa的56.89倍。在裂头蚴阶段,只有Sm LAPc有转录,没有检测到Sm LAPa和Sm LAPb的转录。结论在3个Sm LAPs亚类基因中,Sm LAPc是裂头蚴病更有价值的免疫诊断分子。

曼氏裂头蚴糖原磷酸化酶的生物学特性分析及功能域克隆、表达

目的通过生物信息学软件分析曼氏裂头蚴(Sparganum mansoni,Sm)糖原磷酸化酶(glycogen phosphorylase,GP)的生物学特性,并对SmGP功能域(fSmGP)进行基因克隆及蛋白原核表达。方法利用生物信息学相关软件,分析Sm GP基因的生物信息学特征。通过PCR扩增得到功能域序列片段,克隆至原核表达载体pET-28α,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达fSmGP,并对表达蛋白进行western blot鉴定。结果Sm GP蛋白由519个氨基酸残基组成,相对分子质量为59.80 kDa,等电点为6.95,由C、H、N、O、S 5种原子组成。SmGP的序列与其他物种的氨基酸序列一致性在70%以上。其氨基酸序列中具有32个磷酸化位点、10个潜在的B细胞表位和15个潜在的T细胞表位。在二级结构中,以α螺旋为主,三维空间结构分析显示以二聚体形式存在,且分子中的功能位点空间分布集中。PCR、双酶切鉴定、测序结果均表明pET-28α-fSmGP的功能区重组质粒构建成功;western blot结果显示成功诱导fSmGP蛋白表达。结论SmGP属于Glycosyltransferase-GTB-type超基因家族,是一个高度保守的蛋白分子,但在蛋白分子的C端是功能区域较为集中和表位集中的区域,表达该功能域为后续对fSmGP免疫学分析等实验提供了指导,同时也为研究曼氏裂头蚴的糖代谢规律奠定了一定基础。

海南省类鼻疽病151例流行病学特征及其病原菌耐药性

目的分析海南省151例类鼻疽病例的流行病学特征及类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei,BP)耐药性情况,为类鼻疽病的诊断治疗以及合理预防提供依据。方法收集海南医学院第二附属医院2013年1月1日—2022年8月31日门诊就诊和住院151患者和送检标本分离及鉴定的BP株类鼻疽病例的临床资料及其病原菌的耐药特性,并采用SPSS26.0软件进行统计学分析。结果151例BP感染患者中,男性138例(91.4%),女性13例(8.6%),45~<60岁患者最多,共74例(49.0%);类鼻疽病发病时间集中于10月(19.2%)、11月(19.2%)、8月(9.9%)、7月(8.6%),确诊人数呈上升趋势且确诊时间均<10 d。来自内科(31.1%)、外科(26.5%)和重症医学科(20.5%)是收治类鼻疽病常见的科室。血液(49.0%)、痰液(9.9%)、伤口分泌物(8.6%)是检出BP的主要临床标本。BP感染患者以肺部感染(68.2%)、脓毒血症(35.1%)、局部化脓性感染(23.8%)位居临床表现的前列。类鼻疽病治疗有效率为74.8%,肝功能异常是影响类鼻疽病疗效的危险因素(χ^(2)=5.010,P<0.05),BP菌株对甲氧苄啶/磺胺甲恶唑(SXT)、多西环素(DOX)、亚胺培南(IPM)、头孢他啶(CAZ)、阿莫西林/克拉维酸(AMC)和四环素(TCY)的敏感率分别为98.7%、97.2%、96.7%、94.0%、93.2%和90.7%。结论类鼻疽病容易造成误诊或漏诊,应加强本地区类鼻疽病流行性特征和危险因素的认识;BP对常用抗菌药物的敏感性呈现一定水平的下滑趋势,临床应规范用药并加强耐药性的监测,以提高类鼻疽病治疗的有效率。

人芽囊原虫感染小鼠血清中IL-17水平的动态观察

目的观察小鼠感染人芽囊原虫后血清中白细胞介素17(IL-17)水平的动态变化,从细胞因子的角度来探讨IL-17在人芽囊原虫感染中的意义。方法 BABL/C小鼠120只随机分为实验组、免疫抑制剂组、对照组,每组各40只,三组小鼠分别于感染后第2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d、10d、12d、14d各取4只,采用ELISA试剂盒检测小鼠血清中IL-17水平。结果免疫抑制剂组和对照组小鼠血清中IL-17的含量在不同感染时期基本处于稳定水平(P>0.05),而感染后不同时期的实验组小鼠血清IL-17水平出现升高,差异有统计学意义(P<0.05),其中第4d、5d、6d的表达分别高于免疫抑制剂组和对照组(P<0.05),且第5d达到高峰。结论提示了IL-17可能在人芽囊原虫早期感染中发挥了重要作用。

人芽囊原虫感染小鼠肠黏膜IL-17和IL-23的表达及意义

目的观察人芽囊原虫(Blastocystis hominis)感染小鼠肠道组织中白细胞介素17(IL-17)和IL-23的表达情况。方法30只BABL/c小鼠随机分为实验组、免疫抑制剂组和对照组,实验组和免疫抑制剂组小鼠腹腔注射地塞米松2 mg/只,日1次,连续5 d;对照组小鼠腹腔注射生理盐水0.2 ml/只。实验组每鼠经口感染107个人芽囊原虫,免疫抑制组和对照组每鼠经口灌服0.5 ml生理盐水。感染人芽囊原虫5 d后,剖杀小鼠,分别取十二指肠、空肠、回肠和结肠制作成组织切片,HE染色检查小鼠肠黏膜病变,免疫组化法检测各肠黏膜中IL-17和IL-23的表达水平。结果HE染色显示,肠道黏膜有不同程度炎症改变。IL-17和IL-23在实验组小鼠不同肠黏膜中的表达均显著高于免疫抑制剂组和对照组(P<0.05),而免疫抑制剂组与对照组IL-17和IL-23在小鼠不同肠黏膜中的表达差异无统计学意义(P>0.05)。IL-17在实验组小鼠十二指肠、空肠、结肠黏膜中的表达水平均显著高于回肠黏膜(P<0.05),IL-23在实验组小鼠十二指肠、空肠黏膜中的表达水平显著高于回肠和结肠黏膜(P<0.05)。结论IL-17和IL-23参与人芽囊原虫感染的免疫反应,且IL-17与IL-23在人芽囊原虫感染的免疫应答过程中有一定的相互调节作用。

曼氏迭宫绦虫翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)的真核表达、虫体组织和亚细胞定位及免疫保护效果评价

目的了解曼氏迭宫绦虫翻译控制肿瘤蛋白(SmTCTP)的虫体组织定位,并以Vero细胞为代替模型观察其亚细胞定位,观察重组抗原在曼氏裂头蚴感染的小鼠中的免疫保护效果。方法构建pEGF-N1-SmTCTP真核表达质粒并转染Vero细胞,利用激光共聚焦荧光显微镜观察SmTCTP重组蛋白在Vero细胞中的分布及亚细胞定位;采用免疫组化法观察SmTCTP在曼氏迭宫绦虫成虫组织中的分布。利用重组抗原做动物免疫保护试验,免疫组小鼠注射重组SmTCTP与等体积完全佐剂混合物,空质粒对照组小鼠注射同重组SmTCTP蛋白等量的GST蛋白与等体积完全佐剂混合物,PBS对照组注射相同体积的PBS溶液。每组动物均免疫3次,采用腹腔内部注射,每次免疫注射量为100μl/只,抗原剂量为50μg/只。第3次免疫后的第2周,所有小鼠均经灌胃感染曼氏裂头蚴5条/只,感染后第6周处死并解剖,收集曼氏裂头蚴并计数,计算曼氏裂头蚴的减虫率。结果双酶切和DNA测序鉴定真核表达重组质粒pEGFN1-SmTCTP构建成功,激光共聚焦观察细胞质与细胞核中均有重组SmTCTP分布,但主要分布在细胞核;免疫组化检测SmTCTP主要分布于曼氏迭宫绦虫成虫的子宫、睾丸和卵黄腺处。动物实验显示,攻虫感染6周的重组质粒SmTCTP免疫小鼠检虫数为(1.00±0.816)条,空质粒组为(2.60±0.966)条,PBS对照组为(3.00±0.738)条,且重组SmTCTP免疫小鼠减虫率为66.7%。结论成功构建pEGF-N1-SmTCTP重组质粒,并在Vero细胞中获得了表达。SmTCTP主要定位于曼氏迭宫绦虫成虫的生殖系统,其引发的信号传递可能对曼氏迭宫绦虫生殖系统的发育和功能起调控作用。重组蛋白SmTCTP可诱导小鼠产生抗曼氏迭宫绦虫裂头蚴的免疫保护作用。

曼氏迭宫绦虫翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)的原核表达、纯化及其免疫原性分析

目的原核表达、纯化曼氏迭宫绦虫翻译控制肿瘤蛋白(Sm TCTP),并分析其免疫原性。方法构建曼氏迭宫绦虫翻译控制肿瘤蛋白重组表达质粒pGEX-4T-1-Sm TCTP,转化大肠埃希菌BL21菌株后用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达TCTP蛋白,用GST树脂纯化表达产物,并进行SDS-PAGE电泳分析,通过Western blot鉴定重组蛋白的免疫原性。结果 PCR、双酶切、测序结果均表明pGEX-4T-1-Sm TCTP重组质粒构建成功,并在大肠埃希菌中表达可溶性目的蛋白,经GST树脂纯化后获得高纯度的重组目的蛋白。SDS-PAGE分析表达产物为GST融合蛋白,分子质量单位为45ku,与Sm TCTP和GST融合蛋白理论分子质量相符。Western blot显示重组融合蛋白能被相应大鼠抗血清识别。结论成功进行了Sm TCTP的原核表达并获得纯化的重组蛋白,重组蛋白具有良好的免疫原性,为研究Sm TCTP的功能奠定了基础。

一种基于实时荧光定量PCR的寨卡病毒检测方法的建立

目的建立一种基于实时荧光定量PCR技术的寨卡病毒检测方法。方法根据代表性亚洲型、非洲型寨卡病毒株NS5基因序列,设计特异性引物ZK-1F/R、ZK-2F/R;利用PCR、Real-time PCR方法对引物特异性、灵敏度、可重复性进行评价和优化;利用寨卡病毒感染细胞对本方法进行验证。结果 PCR结果表明两对引物的特异性良好,其Real-time PCR检测灵敏度分别为1.0×103copies/μL和1.0×101copies/μL,扩增效率分别为0.68和0.90,说明引物ZK-2F/R的综合效果优于ZK-1F/R,通过优化实验条件建立基于引物ZK-2F/R的实时荧光定量PCR检测方法,对含有寨卡病毒PRVABC59株和MR766株的样本进行检测,结果分别为9.0×104copies/μL、8.5×104copies/μL。结论本研究建立了一种检测寨卡病毒的方法,可用于临床患者ZIKV感染的检测和预防。

曼氏迭宫绦虫亮氨酸氨基肽酶(SmLAP)的生物信息学分析、克隆及表达

目的利用生物信息学方法分析曼氏迭宫绦虫亮氨酸氨基肽酶(SmLAP)基因的结构和功能,并将该基因克隆至原核表达载体在大肠埃希菌中进行原核表达并纯化,为进一步研究其功能奠定基础。方法利用生物信息学相关软件,分析SmLAP基因及其编码蛋白的结构、生物学和免疫学功能特征。通过PCR扩增得到目的基因,克隆至原核表达载体pGEX-4T1中,转化感受态E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的重组蛋白利用GST标签层析柱纯化,采用12%SDS-PAGE分析蛋白纯度。结果曼氏迭宫绦虫LAP基因ORF finder显示核酸序列为1 662bp,编码554个氨基酸,预测在第21个氨基酸的位置出现信号肽。切除信号肽后的核酸序列为1 083bp,编码360个氨基酸,理论分子质量单位为40ku,与人LAP基因序列相似性为38%。将SmLAP和人B细胞抗原表位预测结果比对,相似度极低。构建的原核表达载体pGEX-4T1-SmLAP转化入大肠埃希菌后用IPTG进行诱导表达,目的蛋白主要以包涵体的形式存在。通过超声破碎、尿素溶解包涵体、透析、GST层析柱后获得单一组分的重组蛋白。结论构建的原核表达系统能表达SmLAP蛋白。生物信息学分析SmLAP是一个有潜在应用价值的免疫诊断分子,且主要以包涵体形式存在。