白术内酯Ⅲ调控ASCT2介导的线粒体-溶酶体互作诱导肝星状细胞衰老的抗肝纤维化机制研究

目的探究白术内酯Ⅲ诱导肝星状细胞(Hepatic stellate cell,HSC)衰老抗肝纤维化作用及机制。方法ASCT2 siRNA及白术内酯Ⅲ(40μmol·L^(-1))分别作用于人源肝星状细胞LX2以抑制ASCT2,MTT评估细胞活力,EdU法检测细胞增殖,细胞衰老β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色检测细胞衰老;Western blot检测LX2细胞中LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的变化,激光共聚焦检测LC3自噬流和错误蛋白堆积的变化,同时观察溶酶体标记物LAMP1的荧光情况,以检测溶酶体功能和数量;试剂盒检测LX2细胞内ROS、MDA水平及SOD活力,流式细胞术分析线粒体ROS水平及膜电位。构建CCl 4诱导的小鼠肝纤维化模型,白术内酯Ⅲ20、30、40 mg·kg^(-1)治疗性给药,HE、Masson和Sirius Red染色观察肝脏组织破坏以及胶原沉积情况,Western blot检测各组小鼠P21、P16表达水平,SA-β-Gal染色以及免疫组化分析衰老细胞的情况和来源。结果抑制ASCT2后,LX2细胞活力降低、衰老增加(P<0.01),同时细胞自噬功能增强、溶酶体数量增多但功能减弱,加入氯喹(Chloroquine,CQ)清除溶酶体后,细胞活力和自噬功能增加(P<0.01)。抑制ASCT2后,LX2细胞内MDA、ROS水平上升,SOD活力下降(P<0.01),其中线粒体ROS水平上升及膜电位下降(P<0.01),加入鱼藤酮后,细胞氧化还原稳态和溶酶体数量恢复(P<0.01)。体内实验结果表明,与模型组比较,白术内酯Ⅲ改善肝组织结构破坏以及胶原沉积,诱导肝纤维化小鼠肝组织中的HSC发生衰老,抑制HSC活化标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达,促进衰老指标P16、P21的表达(P<0.01)。结论白术内酯Ⅲ通过抑制ASCT2诱导线粒体ROS增多、膜电位下降,进一步促进HSC自噬功能增强、溶酶体数量增多和功能减弱,从而诱导活化型HSC发生衰老。