南方红豆杉MCT基因克隆、功能验证及组织表达特异性检测

【目的】克隆南方红豆杉的2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胱氨酰转移酶(MCT)基因(TcMCT),分析其功能,并检测组织表达特异性,为深入研究TcMCT基因在紫杉醇生物合成中的作用机制提供理论依据。【方法】采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得TcMCT基因的cDNA全长序列,对其编码蛋白进行生物信息学分析及亚细胞定位,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测TcMCT基因的组织表达模式,并在大肠杆菌中超表达该基因以验证其功能。【结果】克隆获得的TcMCT基因cDNA序列全长为1293 bp,开放阅读框(ORF)为942 bp,编码313个氨基酸。TcMCT蛋白与其他植物MCT蛋白中均含保守的MEP结合位点和CTP结合位点,但在N端氨基酸序列保守性较差,其中与同为裸子植物银杏GbMCT蛋白的亲缘关系最近,氨基酸序列的相似性为59.3%。TcMCT蛋白的三级结构与AtMCT蛋白相似,均属于同源二聚体。TcMCT蛋白N端含84个氨基酸残基的质体转运肽,且以Arg88作为切割位点,定位于叶绿体中。TcMCT基因在南方红豆杉不同组织中均有表达,在绿色树皮中的相对表达量显著高于其他组织(P<0.05,下同),且在老叶和嫩叶中的相对表达量显著高于茎和根,在茎和根中的表达量极少甚至不表达。大肠杆菌中超表达TcMCT基因可促进β-胡萝卜素大量积累。【结论】不同物种MCT氨基酸序列具有较高的保守性,TcMCT基因具有明显的组织表达特异性,可调控萜类物质如β-胡萝卜素等的生物合成,推测其在紫杉醇生物合成中发挥重要调控作用。

青蒿JAZ基因克隆及其功能分析

茉莉酸(jasmonic acid,JA)能诱导青蒿素生物合成,为进一步解析青蒿JA信号通路,本研究从青蒿中克隆并鉴定2个JA信号通路中的负调控因子JAZ(jasmonate ZIM-domain)基因,分别命名为AaJAZ5和AaJAZ6。这两者均含有JAZ家族特有的保守区域ZIM和Jas。AaJAZ5在叶中表达量最高,其他部位的表达量较低;AaJAZ6在根中的表达量最高,茎中的表达量最低。茉莉酸甲酯(Me JA)和机械伤害处理都能显著提高AaJAZ5和AaJAZ6的表达。通过双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,Bi FC)证明,AaJAZ5和AaJAZ6均能与Aa MYC2相互作用,而只有AaJAZ5与Aa COI1存在相互作用,表明AaJAZ5在JA信号通路中可能具有更加重要的作用。本研究为进一步分析青蒿JAZ家族成员的功能分化和JA信号调控青蒿素生物合成的分子机制奠定了基础。