中性粒细胞来源MMP-8对腐皮镰刀菌性角膜炎的组织损伤作用及其机制

目的研究小鼠腐皮镰刀菌性角膜炎中中性粒细胞来源的基质金属蛋白酶8(MMP-8)对角膜组织的损伤作用及其机制。方法取108只6~8周龄雄性SPF级C57BL/6J小鼠,采用腐皮镰刀菌感染法制备右眼真菌性角膜炎(FK)模型,裂隙灯显微镜下观察小鼠角膜炎症情况并评分,依据FK模型眼角膜炎症评分将模型眼分为造模后0、12、24、48和72 h组。于相应时间点处死小鼠并取材角膜组织,采用Western blot法检测MMP-8、腺苷酸激活蛋白激酶α(AMPKα)及其丝氨酸172位点磷酸化形式(p-AMPKα)蛋白在角膜中的相对表达量;采用苏木精-伊红染色法检测各时间点组小鼠角膜中中性粒细胞数量;采用免疫荧光染色法观察角膜中中性粒细胞与MMP-8蛋白的共定位表达。体外角膜胶原降解实验中将角膜组织分为MMP-8组、缓冲液组和生理盐水组,分别采用100μl活化的重组MMP-8、检测缓冲液和生理盐水处理角膜,采用羟脯氨酸检测试剂盒测定并比较各组角膜组织中羟脯氨酸质量分数。分别提取人外周血中性粒细胞和采集培养的腐皮镰刀菌孢子,将人中性粒细胞分为4个组,其中阴性对照组为培养的中性粒细胞,共培养组为中性粒细胞加孢子共培养,AICAR处理组和化合物C处理组分别向中性粒细胞和孢子共培养体系内加入p-AMPK蛋白酶激动剂AICAR和抑制剂化合物C,采用免疫荧光染色法检测各组人中性粒细胞中MMP-8蛋白的表达水平。结果造模后24 h组小鼠模型眼出现角膜混浊,造模后72 h组出现角膜穿孔。造模后24、48和72 h组角膜炎症评分均高于12 h组,差异均有统计学意义(均P<0.001)。造模后12、24和48 h组角膜中MMP-8蛋白相对表达量高于0 h组,差异均有统计学意义(均P<0.001);模型眼角膜中MMP-8蛋白相对表达量与炎症评分呈中等强度正相关(r s=0.50,P<0.05)。造模后24、48和72 h组角膜内p-AMPKα(Thr 172)/AMPKα值高于0 h组,差异均有统计学意义(均P<0.05);角膜中p-AMPKα(Thr 172)/AMPKα值与MMP-8蛋白相对表达量呈中等强度正相关(r=0.54,P<0.01)。造模后24、48和72 h组角膜中中性粒细胞数目明显多于0 h组,差异均有统计学意义(均P<0.001);角膜中中性粒细胞数目与炎症评分呈强正相关(r s=0.77,P<0.001),与MMP-8蛋白相对表达量呈中等强度正相关(r=0.56,P<0.05)。模型眼角膜中MMP-8蛋白表达与中性粒细胞高度共定位。缓冲液组、生理盐水组和MMP-8组角膜羟脯氨酸质量分数分别为(0.52±0.02)、(0.51±0.03)和(0.27±0.02)μg/mg,组间总体比较差异有统计学意义(F=156.63,P<0.01),其中MMP-8组角膜羟脯氨酸质量分数低于缓冲液组和生理盐水组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。培养的镰刀菌孢子感染人中性粒细胞实验中,AICAR处理组MMP-8表达荧光强度值明显高于阴性对照组和化合物C处理组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论小鼠真菌性角膜炎中性粒细胞分泌的MMP-8可降解角膜基质层胶原纤维,导致角膜混浊或穿孔。人中性粒细胞中MMP-8蛋白的表达水平变化可能与AMPK活化有关。

血小板对巨噬细胞抑制和吞噬真菌的促进作用

目的研究血小板在巨噬细胞杀伤真菌中的作用。方法培养小鼠巨噬细胞系(RAW264.7),提取腐皮镰孢菌孢子,分离小鼠血小板。实验分为单纯孢子组、孢子+巨噬细胞组和混合血小板组,分别接种真菌孢子、等比例孢子+巨噬细胞以及血小板+孢子+巨噬细胞进行培养。分别于培养后1、2、3和4 h于转盘式激光扫描共焦显微镜上任意选取各组5个视野进行拍照,计算各组巨噬细胞吞噬率、吞噬指数和真菌孢子出芽率,于培养后4、6和8 h观察并测量各组菌丝伸长度。设置单纯巨噬细胞组、孢子+巨噬细胞组和混合血小板组,应用细胞分析仪进行细胞毒性测定。结果混合血小板组培养后1、2、3和4 h的巨噬细胞吞噬率和吞噬指数均明显高于相应时间点孢子+巨噬细胞组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。培养后1、2、3和4 h各组孢子出芽率总体比较差异均有统计学意义(H=60.05、37.89、55.15、60.52,均P<0.001);孢子+巨噬细胞组培养后1、2、3和4 h孢子出芽率均低于相应时间点单纯孢子组,而混合血小板组培养后1、3和4 h孢子出芽率均低于孢子+巨噬细胞组,差异均有统计学意义(均P<0.01)。培养后4、6和8 h时各组菌丝伸长度总体比较差异均有统计学意义(H=13.76,P=0.001;H=43.57、P<0.001;H=60.87,P<0.001);培养4、6和8 h时孢子+巨噬细胞组菌丝伸长度均低于相应时间点单纯孢子组,培养6 h和8 h混合血小板组菌丝长度均低于相应时间点孢子+巨噬细胞组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。培养后0、6、12、18和24 h各组细胞指数总体比较差异均无统计学意义(F=0.02、1.08、1.61、1.58、2.52,均P>0.05)。培养后30、36、42和48 h各组细胞指数总体比较,差异均有统计学意义(F=10.81、8.08、5.61、5.72,均P<0.05);孢子+巨噬细胞组细胞指数明显低于单纯巨噬细胞组,差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论血小板可促进巨噬细胞对真菌的吞噬和抑制作用,并且可能有拮抗真菌细胞毒性的作用。

双醋瑞因对眼表常见病原菌的体外抑制作用

目的研究双醋瑞因对眼表常见病原菌的体外抑菌作用。方法采集于河南省立眼科医院就诊的眼表感染患者中分离培养的革兰阳性球菌和杆菌、革兰阴性杆菌、丝状真菌及念珠菌。采用K-B琼脂纸片扩散法测定双醋瑞因对病原菌的体外抑菌活性,采用微量液基稀释法进行最低抑菌浓度(MIC)定量测定。以左氧氟沙星和伏立康唑分别为抗细菌药物和抗真菌药物对照。结果双醋瑞因对眼表分离的42株革兰阳性球菌和10株革兰阳性杆菌均有明显抑菌活性,双醋瑞因与左氧氟沙星对表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、中间葡萄球菌和革兰阳性棒状杆菌抑菌圈直径比较,差异无统计学意义(均P>0.05)。双醋瑞因对眼表分离的23株革兰阴性杆菌,10株丝状真菌和3株念珠菌均无抑制作用。双醋瑞因对表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、中间葡萄球菌及其他葡萄球菌的MIC范围为1~32μg/ml,MIC90分别为16、8、16、32μg/ml。结论双醋瑞因对眼表分离的革兰阳性葡萄球菌和棒状杆菌具有体外抑菌活性,对致病革兰阴性杆菌和真菌无抑菌活性。

高糖饮食对小鼠真菌性角膜炎的影响

目的探究高糖饮食对小鼠真菌性角膜炎的影响。方法选取健康无眼疾的雄性C57BL/6J小鼠78只,随机分为高糖饮食组和模型对照组,每组36只,模型对照组给予正常饮用水,高糖饮食组给予含体积分数10%果糖溶液,每2 d测量两组小鼠体质量及血糖,10 d后建立真菌性角膜炎模型。造模后24 h、36 h、48 h、72 h、96 h、120 h、168 h裂隙灯显微镜下对角膜进行临床评分并拍照。处死小鼠后,取角膜组织进行HE染色和PAS染色;测定角膜内中性粒细胞和巨噬细胞浸润体积。利用酶联免疫吸附实验对小鼠角膜内的白细胞介素-1β含量进行测定。结果造模后0～14 d,两组小鼠体质量与血糖差异均无统计学意义(均为P>0.05)。造模后24 h、36 h、48 h、120 h、168 h,高糖饮食组小鼠角膜临床评分均明显高于模型对照组,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。高糖饮食组小鼠角膜穿孔率79.5%,高于模型对照组的40.9%,差异有统计学意义(P=0.000)。造模后各时间点,高糖饮食组中性粒细胞浸润体积均高于模型对照组,差异均有统计学意义(均为P=0.000)。造模后72 h、96 h、120 h、168 h,高糖饮食组巨噬细胞浸润体积均高于模型对照组(均为P=0.000)。角膜组织病理学检查结果示,高糖饮食组炎症反应更重,角膜组织破坏更早且更为严重。造模后24 h、48 h高糖饮食组白细胞介素-1β含量均明显高于模型对照组(均为P<0.05)。结论高糖饮食加重了真菌性角膜炎感染的严重程度,增强了中性粒细胞、巨噬细胞的趋化,促进了IL-1β的分泌。

血小板体外对中性粒细胞抗真菌作用的影响

目的:研究血小板对中性粒细胞体外抗真菌作用的影响。方法:实验真菌为腐皮镰胞菌标准株。分别分离健康人外周血中的中性粒细胞(N)和血小板(PL)。预先分别用钙荧光白、抗人CD15-FITC和抗人CD41a-PE标记真菌孢子(S)、中性粒细胞和血小板。将中性粒细胞5×10^(5)个/孔均匀接种于培养板。①设定S+N组、S+N+PL组,按照S∶N∶PL个数1∶1∶20接种,分别于培养1、2、4 h后测定中性粒细胞吞噬率。②设置S组、S+N组、S+N+PL组,按照S∶N∶PL个数比例为1∶5∶100接种;分别于培养1、2、4 h后测定孢子出芽率;分别于培养4、6、8 h后测量菌丝伸长度。③设置N组、S+N组、S+N+PL组,按照S∶N∶PL个数为1∶5∶100接种,分别于培养6、10、14、18 h后,Annexin V/PI双染法检测中性粒细胞凋亡率。结果:S+N+PL组中性粒细胞吞噬率大于S+N组(P<0.05)。S+N+PL组孢子出芽率、菌丝伸长度小于S+N组,S+N组小于S组(P<0.05)。S+N+P组中性粒细胞凋亡率小于N组和S+N组(P<0.05)。结论:血小板可体外增强中性粒细胞的抗真菌作用。

水杨醛L-丝氨酸的酸碱性质及金属离子传感性能

利用紫外-可见吸收光谱研究了水杨醛L-丝氨酸的酸碱性质及其对金属离子的传感性能。研究结果表明水杨醛L-丝氨酸在p H=0~12.60之间发生三步质子化/去质子化反应;水杨醛L-丝氨酸对Zn2+、Pb2+、Cd2+离子具有较好的传感作用。

双醋瑞因减轻小鼠角膜碱烧伤炎症反应的实验研究

目的探讨双醋瑞因减轻小鼠角膜碱烧伤炎症反应的作用。方法将174只小鼠角膜碱烧伤造模成功的小鼠随机分为三组:双醋瑞因组、地塞米松组和生理盐水组,分别给予双醋瑞因、地塞米松、生理盐水滴眼制剂滴眼,比较造模后2 d、3 d、4 d、5 d各组小鼠的角膜混浊度、病灶面积、上皮缺损面积及炎症细胞的浸润情况。结果双醋瑞因组造模后4 d、5 d角膜临床评分明显较生理盐水组低(均为P<0.01),地塞米松组造模后3 d、4 d、5 d角膜临床评分较生理盐水组低(均为P<0.05)。对于角膜上皮缺损而言,双醋瑞因组碱烧伤后各时间点角膜上皮缺损面积均小于生理盐水组(均为P<0.05),地塞米松组与生理盐水组角膜上皮缺损无明显差异。对角膜中性粒细胞进行统计发现,双醋瑞因组碱烧伤后各时间点中性粒细胞计量明显少于生理盐水组(均为P<0.01);地塞米松组造模后3 d、5 d中性粒细胞浸润少于生理盐水组(均为P<0.05)。对巨噬细胞进行统计发现,双醋瑞因组造模后3 d、5 d巨噬细胞均较生理盐水组浸润少(均为P<0.05);造模后5 d地塞米松组浸润少于生理盐水组(P<0.05)。通过MPO活性测定发现,双醋瑞因组和地塞米松组造模后2 d、3 d、5 d MPO活性均较生理盐水组明显降低(均为P<0.01)。结论双醋瑞因能够减轻小鼠角膜碱烧伤的炎症反应,改善角膜碱烧伤的预后。

玉米须水提液喷雾干燥工艺优选

目的:优选玉米须水提液喷雾干燥工艺条件,为玉米须配方颗粒的制备提供参考。方法:在单因素试验基础上,以总黄酮、总多糖含量及出粉率、水分的综合评分为指标,通过正交试验考察进风温度、空气流量和进料量对玉米须水提液喷雾干燥工艺的影响。采用UV测定总黄酮和总多糖含量,检测波长分别为400,490 nm。结果:最佳喷雾干燥工艺条件为进风温度180℃,进料量20%,空气流量800 L·h-1。总黄酮、总多糖质量分数及水分、出粉率平均值分别为0.14%,2.71%,5.81%,91.33%。结论:优化的喷雾干燥工艺稳定可行,为玉米须配方颗粒的品种开发和工业化生产提供参考。

眼前节不同部位分离出的耐药葡萄球菌对常用眼用抗生素的敏感性分析

目的探讨眼前节不同部位分离出的耐药葡萄球菌对左氧氟沙星、妥布霉素、头孢唑啉钠、夫西地酸、克林霉素的敏感性。方法横断面研究。收集2018年1月至2019年5月河南省立眼科医院微生物室从67例(67只眼)眼前节感染患者的结膜囊、角膜、睑缘及泪囊采集的标本中分离出的67株耐药葡萄球菌的资料进行研究。患者中男性37例,女性30例;年龄(35.18±24.69)岁;结膜炎33例、细菌性角膜炎6例、睑缘炎7例、新生儿泪囊炎9例、成人泪囊炎1例、其他感染性眼病11例。通过细菌测定系统随机体外诊断试剂板(DL-STAPH葡萄球菌)对菌株的耐药机制类型[耐甲氧西林(MRS)株和(或)产β内酰胺酶(β-Lac)]进行鉴定,依据美国临床和实验室标准化研究所的M100标准,对微量液基法测出的最小抑菌浓度进行敏感和耐药的判定。采用卡方或Fisher确切检验对数据进行统计学分析。结果67株耐药葡萄球菌中MRS株35株、产β-Lac株30株、产β-Lac MRS株2株。泪囊、角膜、睑缘和结膜囊的MRS株分别有3、9、4、19株,占各部位分离出总菌株数的3/4、9/12、4/8、19/43(44.2%);产β-Lac株分别有1、3、3、23株,占各部位分离出总菌株数的1/4、3/12、3/8和23/43(53.5%)。结膜囊分离出的产β-Lac株中来自诊断为结膜炎的患者有17株,占比最高(25.3%);角膜和泪囊分离出的MRS株中来自诊断为细菌性角膜炎和新生儿泪囊炎患者的分别为5(7.5%)和3株(4.5%);睑缘分离出的MRS株、产β-Lac株来自睑缘炎患者的均为3株(4.5%)。睑缘和结膜囊分离出的菌株中以耐药表皮葡萄球菌为主,泪囊和角膜分离出的菌株以耐药金黄色葡萄球菌为主。35株MRS株中,分别有25、24、12、12、11株对头孢唑啉钠、夫西地酸、左氧氟沙星、克啉霉素和妥布霉素敏感,敏感率分别为71.4%、68.6%、34.3%、34.3%和31.4%,差异有统计学意义(χ^(2)=22.756,P<0.01),且4个眼前节部位分离出的MRS株对左氧氟沙星、妥布霉素、头孢唑啉钠、夫西地酸及克林霉素的敏感性差异均有统计学意义(χ^(2)=18.493,11.594,8.906,9.841,16.059;均P<0.05),角膜的MRS株对5种抗生素的敏感性差异有统计学意义(χ^(2)=33.080,P<0.001)。30株产β-Lac株中,分别有27、22、19、16、8株对头孢唑啉钠、夫西地酸、左氧氟沙星、妥布霉素和克林霉素敏感,敏感率分别为90.0%、73.3%、63.3%、53.3%和26.7%,差异有统计学意义(χ^(2)=28.280,P<0.001)。4个眼前节部位分离出的产β-Lac株对5种抗生素的敏感性差异均有统计学意义(χ^(2)=50.971,24.543,48.147,44.899,18.676;均P<0.01);结膜囊分离出的产β-Lac株对5种抗生素敏感性的差异有统计学意义(χ^(2)=23.383,P<0.01)。产β-Lac株对头孢唑啉钠和夫西地酸的敏感性高于MRS株。结论头孢唑啉钠和夫西地酸可能是治疗眼前节结膜囊、角膜、睑缘及泪囊4个部位耐药葡萄球菌感染的较优选择,尤其是产β-Lac耐药葡萄球菌的感染。