家蚕基质金属蛋白酶基因Bm-MMP的克隆、序列分析及表达研究

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)家族是一类蛋白水解酶,能够降解基底膜和细胞外基质中大部分蛋白质。为了研究MMPs对家蚕Bombyxmori基本生理功能的影响,本文利用RACE和RT-PCR方法,首次从家蚕蛹中克隆了一个MMP基因的全长cDNA,命名为Bm-MMP。序列分析表明,Bm-MMP的mRNA存在两个选择性剪切变体,分别命名为Bm-MMP-V1和Bm-MMP-V2。其中Bm-MMP-V1cDNA全长为2257bp,包含一个1686bp的开放阅读框,编码561个氨基酸,预测蛋白质分子量约为62.3kD;Bm-MMP-V2cDNA全长为2188bp。同源性分析表明,Bm-MMP-V1和Bm-MMP-V2的氨基酸序列与蜡螟Galleria mellonella的Gm1-MMP的氨基酸序列同源性最高,均为88.8%;与黑腹果蝇Drosophila melanogaster的Dm1-MMP的氨基酸序列同源性,分别为61.2%和64.3%。将Bm-MMP-V1的编码区连接到表达载体pET28a(+)上,并在大肠杆菌BL21中进行原核表达,SDS-PAGE和Western blot分析结果表明,带有6×His标签的融合蛋白被成功表达。半定量RT-PCR分析表明,Bm-MMP-V1和Bm-MMP-V2在4龄眠蚕、熟蚕、吐丝后36及48h、预蛹中的表达量比5龄中食期与化蛹后的表达量高,推测该基因与家蚕幼虫蜕皮变态有关;LPS诱导5龄3d的幼虫,其Bm-MMP-V1和Bm-MMP-V2在血液中的表达量升高,推测Bm-MMP可能与免疫相关。本研究为进一步研究Bm-MMP在家蚕体内的作用机制奠定了基础。

家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因serpin-6的克隆、序列分析和组织表达

本文利用RT-PCR和RACE方法,获得了家蚕Bombyxmori丝氨酸蛋白酶抑制剂基因(serpin)的开放读码框(ORF)和5′UTR序列。根据该基因与其他昆虫serpin的同源性关系将其命名为家蚕serpin-6基因,GenBank登录号EU159447。为了研究serpin-6与家蚕免疫反应的相关机理,对serpin-6基因的组织表达和免疫刺激反应进行了研究。结果表明该基因在家蚕的头部和生殖腺中mRNA表达量非常高,在中肠,脂肪体,丝腺和血淋巴表达量较低。用脂多糖(LPS)刺激5龄第3d家蚕后,serpin-6基因在脂肪体和血淋巴中都被显著诱导表达,且都在刺激6h后表达量最高。推测该基因在家蚕细胞免疫反应中起着一定的作用。

棉铃虫羧酸酯酶基因的克隆、序列分析及组织表达

为了从分子水平上研究棉铃虫Helicoverpa armigera(Hbner)对杀虫剂抗性的产生机理,本文通过RT-PCR和 RACE方法首次从棉铃虫中肠中克隆了一个羧酸酯酶全长cDNA序列。序列分析表明,该基因包含一个1 794 bp的开放读码框,129 bp的5'UTR和139 bp的3'UTR区域。该基因编码597个氨基酸,推测编码蛋白质的等电点pI为 4.92,分子量为67.1 kD,GenBank登录号为EF547544。通过对氨基酸的同源性分析表明,该羧酸酯酶与斜纹夜蛾 Spodopteralitura羧酸酯酶的同源性最高,达60 %。半定量RT-PCR分析表明,该基因在中肠组织中表达量最高,在脂肪体和生殖腺中表达量较低,在头部则不表达。推测该羧酸酯酶基因可能主要参与棉铃虫对外源物质的解毒代谢。

昆虫免疫蛋白多酚氧化酶的研究进展

多酚氧化酶是无脊椎动物,包括昆虫的重要免疫蛋白,经由受体识别病原物,通过丝氨酸蛋白酶切割激活,数分钟之内在病原物周围发生黑化反应。多酚氧化酶的活性抑制或者基因丢失,导致宿主对大多数病原物抵抗力下降。近年来,随着多酚氧化酶晶体结构的解析,对多酚氧化酶蛋白结构及其活性、抑菌等作用有了新的认识。同时,在昆虫中发现多酚氧化酶可能具有超越免疫的功能,显示对多酚氧化酶的研究具有一定的应用价值。