AJUBA通过磷酸果糖激酶PFKM影响糖酵解调控结直肠癌细胞生长

目的探讨AJUBA对结直肠癌(CRC)细胞的生长代谢功能影响以及引起改变的原因。方法通过使用免疫组织化学技术,比较CRC组织和癌旁组织的AJUBA表达量。随后,使用短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)在人CRC细胞系SW480中敲低AJUBA,并将其分成sh-AJUBA组和sh-NC组(阴性对照组)。使用EdU和细胞计数试剂盒(CCK-8)法,观察敲低AJUBA对肿瘤细胞增殖影响,Seahorse检测其糖酵解水平。通过对RNA测序数据分析,选择糖酵解关键基因磷酸果糖激酶(PFKM),将其过表达后检测增殖能力和糖酵解能力的变化。分别采用t检验和方差分析比较两组或多组间差异。结果CRC癌组织中,AJUBA表达显著升高(60.180±5.046比9.720±2.002,t=15.160,P<0.01)。与sh-NC比较,AJUBA敲低后(0.310±0.212比1.000±0.121,t=9.746,P<0.01),细胞增殖能力出现明显抑制(9.040±1.351比58.470±3.940,t=20.560,P<0.01),糖酵解能力也显著下调(43.770±2.740比100.300±2.555,t=26.120,P<0.01)。在回补PFKM催化后产物丙酮酸后,细胞增殖能力有所恢复。将PFKM过表达后,sh-AJUBA组的增殖能力和糖酵解能力都明显上升(0.90±0.02比0.40±0.02、0.42±0.02比0.18±0.02,t=36.12、15.35,P<0.01;178.30±4.80比146.00±3.30、159.80±10.52比57.15±1.77,t=11.08、19.24,P<0.01、0.001)。结论AJUBA在CRC癌组织中高表达,并通过调控PFKM的表达影响糖酵解而改变细胞增殖能力。

LncRNA SNHG4在结直肠癌中的表达及对细胞奥沙利铂耐药性的影响

目的:探讨长链非编码RNA(LncRNA)SNHG4在结直肠癌(CRC)中的表达以及对细胞奥沙利铂耐药性的影响。方法:采用实时定量PCR(qRT-PCR)法检测24例CRC组织及其邻近癌旁组织中LncRNA SNHG4的表达水平,并用费希尔精确检验(Fisher's exact test)分析LncRNA SNHG4表达水平与CRC患者临床病理特征相关性。体外培养HCT116细胞,将HCT116细胞分为sh-SNHG4组(敲减组)、sh-NC组(阴性对照组),qRT-PCR法检测各组HCT116细胞中LncRNA SNHG4表达水平,CCK8法检测两组细胞经梯度浓度(1.0、2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L)奥沙利铂(L-OHP)处理24小时后细胞增殖能力变化情况。EdU和免疫荧光(Immunofluorescence,IF)实验检测两组细胞经10μmol/L的L-OHP处理24小时后,细胞增殖能力以及核DNA损伤情况。结果:CRC癌组织中LncRNA SNHG4相对表达水平与癌旁组织相比明显升高(P<0.05),其表达水平与CRC患者淋巴结转移、TNM分期、脉管侵犯显著相关(P<0.05)。与sh-NC组相比,sh-SNHG4组在梯度浓度的L-OHP处理下,相对细胞活性下降更加明显(P<0.05)。在10μmol/L的L-OHP处理条件下,sh-SNHG4组相比sh-NC组,细胞增殖能力减弱(P<0.05),核DNA损伤情况更严重(P<0.05)。结论:LncRNA SNHG4在CRC组织中高表达,敲减LncRNA SNHG4可以减弱HCT116细胞对L-OHP耐药性。

结直肠癌细胞外泌体激活肝星状细胞为癌相关成纤维细胞

目的:探讨结直肠癌(CRC)细胞上清外泌体对肝星状细胞(HSC)细胞的影响。方法:通过超高速离心结合过滤法提取和纯化CRC细胞上清外泌体,然后以透射电电子显微镜(TEM)、纳米颗粒跟踪分析仪(NTA)和蛋白免疫印迹(WB)实验鉴定所提取的外泌体的形态、大小、粒径分布,以及外泌体表面标志蛋白HSP90和TSG101。再通过激光共聚焦显微镜(LSCM)观察荧光标记的外泌体被HSC细胞摄取的情况。以WB实验验证CRC细胞上清外泌体处理后的HSC中成纤维细胞活化蛋白(FAP)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达水平。结果:TEM显示结直肠癌细胞外泌体呈"茶托样"杯型或类圆形囊泡样结构;NTA分析发现结直肠癌细胞外泌体直径峰值和大小分布范围分别为57 nm和30-150 nm;WB显示外泌体表面标志蛋白HSP90和TSG101均为阳性。LSCM观察发现Di O标记的外泌体(绿色),能够被Dil标记的HSC(红色)摄取。CRC细胞上清外泌体处理后的HSC中FAP和α-SMA表达水平较对照组显著升高。结论:HSC与CRC细胞上清外泌体共孵育后能够被激活成癌相关成纤维细胞。

长链非编码RNA微小RNA-17-92a-1基因簇宿主基因对结直肠癌细胞奥沙利铂耐药性的调控及机制

目的探讨长链非编码RNA微小RNA(miR)-17-92a-1基因簇宿主基因(MIR17HG)对耐奥沙利铂(L-OHP)结直肠癌细胞株SW480/L-OHP的调控及机制。方法实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)测定MIR17HG含量。SW480/L-OHP中构建MIR17HG敲减组(sh-MIR17HG)和对照组(sh-NC)。细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞活性,流式细胞术检测凋亡。荧光素酶报告实验和蛋白质印迹法检测TOP/FOP比值和β-连环蛋白(β-catenin)等分子表达。CHIR99021处理细胞后检测细胞凋亡率。应用SPSS 20.0软件进行统计分析。结果SW480/L-OHP中MIR17HG含量高于SW480(9.84±0.69比2.22±0.47,t=15.893,P<0.01)。L-OHP刺激后sh-MIR17HG组细胞活性低于sh-NC组(0.715±0.024比0.877±0.015,t=-9.802,P<0.01),凋亡率高于sh-NC组[(25.65±2.85)%比(7.38±0.89)%,t=10.592,P<0.01]。SW480/L-OHP细胞的TOP/FOP比值高于SW480细胞(9.51±1.13比3.67±0.80,t=7.320,P<0.01)。sh-MIR17HG组TOP/FOP比值低于sh-NC组(2.85±0.87比9.17±1.76,t=-5.564,P<0.01),β-catenin水平也低于sh-NC组(8.95±2.07比26.09±2.61,t=-8.908,P<0.01)。CHIR99021刺激组凋亡率低于未刺激组[(13.91±1.69)%比(22.99±3.13)%,t=-4.426,P<0.05]。结论SW480/L-OHP中高表达的MIR17HG可激活Wnt/β-catenin通路,进而促进结直肠癌细胞对L-OHP的耐药性。