钙蛋白酶抑制剂calpeptin对丙烯酰胺所致神经丝磷酸化及相关激酶异常表达的拮抗作用

目的通过制备神经干细胞(NSC)丙烯酰胺(ACR)中毒模型,探讨钙蛋白酶抑制剂calpeptin(CP)对ACR中毒的拮抗作用。方法将新生24 h内Wistar乳大鼠的脊髓背根神经节(DRG)培养48 h制备原代NSC,用抗巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶(NSE)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)单抗,采用免疫荧光染色法鉴定。原代NSC培养至第4天,将其分为细胞对照组、CP组(CP 4μmol·L-1)、ACR染毒组(ACR760μmol·L-1)和ACR+CP组(ACR 760μmol·L-1+CP 4μmol·L-1),培养48 h。采用Western蛋白印迹法检测NSC中蛋白激酶A(PKA),PKC和磷酸化高相对分子质量神经丝(p-NF-H)蛋白表达水平,应用免疫荧光法在荧光显微镜下观察PKA,PKC和p-NF-H蛋白在NSC中的分布和表达。结果经免疫荧光染色法鉴定,制备的原代NSC巢蛋白免疫反应阳性,NSC纯度>90%;经维生素A诱导,该原代NSC可分化成NSE阳性的神经元和GFAP阳性的神经胶质细胞。Western蛋白印迹实验结果表明,与细胞对照组相比,CP组NSC中PKA,PKC和p-NF-H蛋白表达水平无明显变化;ACR组PKA和PKC蛋白表达分别下降41.6%和29.4%(P<0.05),p-NF-H蛋白表达升高66.4%(P<0.05)。与ACR组相比,ACR+CP组PKA和PKC蛋白表达升高68.9%和34.4%(P<0.05),p-NF-H蛋白表达降低18.6%(P<0.05)。免疫荧光法实验结果表明,与细胞对照组相比,CP组NSC中PKA,PKC和p-NF-H荧光强度相近,ACR组PKA和PKC荧光强度减少且分布不均匀,p-NF-H荧光强度增加;与ACR组相比,ACR+CP组NSC中PKA和PKC荧光强度升高且分布均匀,p-NF-H荧光强度减弱。结论 ACR可导致NSC中PKA和PKC蛋白表达降低,p-NF-H蛋白表达升高;CP对ACR导致的上述变化有拮抗作用。

FACS Aria Ⅲ细胞分选参数选择及条件优化

以BGC-823细胞分选为例,探讨FACS Aria Ⅲ细胞分选仪分选参数选择及条件优化的方法。依次采用2种不同规格的喷嘴、3种不同浓度的细胞以及5种不同的分选模式进行分选,比较各种条件下96孔板分选的单细胞入孔率和克隆形成率以及试管式分选的细胞纯度和细胞状态,来确定最优方案。结果显示对于BCG-823类似的细胞,96孔板分选采用100μm喷嘴和5×10^(6)个/mL细胞浓度能获得更高的单细胞入孔率和克隆形成率,对于试管式分选采用100μm喷嘴,5×10^(6)个/mL细胞浓度和4-way purity模式将获得更高的分选后细胞纯度。

大型仪器操作类培训的实践与探索——以流式细胞仪为例

以往针对研究生开展的大型仪器的理论培训存在诸多缺陷,如不结合实际操作的讲解效率低下,学生参与度不高等问题。在充分了解学生需求的基础上,本次尝试了操作培训,以一经典实验为例,完整地演示了从样本制备到上机检测的全过程,不仅参与度高,且获得了学生的高度认可。

以需求为导向指导科研共享平台服务体系的建设

随着科学技术的进步,国家对科研设备投入的加大,全国高校相继建立了科研共享平台,以期整合资源,对仪器设备进行集中管理,实现资源共享、效益最大化。在大数据的时代背景下,科研共享平台资源整合的数量不断增多、种类逐渐丰富,科研共享平台应将服务理念从"以资源为中心"转向"以需求为导向",才能为用户提供更加精准、更加便捷、更加有效的服务。文章以南京医科大学公共卫生学院科研共享平台为例,阐述以用户为中心,以需求为导向,结合学科发展特点来指导科研共享平台服务体系的建立,提高共享服务的工作质量,为科研事业的开展保驾护航。

Annexin V/PI法流式细胞术检测细胞凋亡的影响因素

[目的]探讨消化液、细胞数量及试剂温度对Annexin V/PI法流式细胞术检测细胞凋亡率的影响。[方法]细胞经Accutase或无EDTA胰酶消化后比较检测结果;含有0.5×10^(5)、1×10^(5)、2×10^(5)细胞的样本按照说明书推荐(默认含有1×10^(5)细胞)加入试剂后,比较检测结果;细胞加入室温或4℃试剂后比较检测结果。以上比较均用未处理细胞和秋水仙素处理细胞分别进行。[结果]对于未处理细胞而言,与无EDTA胰酶相比,Accutase能显著减少凋亡率(2.70%vs 18.05%);而经药物处理的细胞,Accutase组凋亡率也有一定程度减少(22.32%vs 26.50%),但差异没有未处理细胞大。未处理细胞随着细胞数量的增加,PI信号并未发生明显改变,Annexin V-FITC信号与细胞数量成反比,统一十字门分析的凋亡率分别是:2.46%、1.85%、1.35%。对于药物处理的细胞差异尤其明显,统一十字门分析的凋亡率分别是:28.83%、21.27%、15.59%,因此不能用统一的十字门分析。加入4℃试剂的未处理细胞的凋亡率明显高于加入室温试剂的细胞的凋亡率(3.77%vs 8.13%),而对于药物处理的细胞,两者基本无差别(22.94%vs 22.18%)。[结论]用Annexin V/PI法流式细胞术检测细胞凋亡率时,使用Accutase消化液;样本严格计数,使细胞数符合说明书要求;使用室温试剂。

丙烯酰胺神经毒性机制研究进展

丙烯酰胺(acrylamide,ACR)广泛应用于生产生活中,研究表明ACR暴露可引起人或动物的神经系统损伤,主要表现为四肢麻木、共济失调、跟腱反射减弱或消失等。近年来,大量研究致力于探讨ACR的神经毒性机制,如细胞骨架蛋白异常改变、氧化应激、能量代谢异常、神经末梢轴突病变等,但其具体机制尚未阐明。该文对ACR的理化性质、体内代谢、中毒后的主要症状与病理特征及ACR的神经毒性主要机制进行综述。

Calpeptin对丙烯酰胺致大鼠大脑微管损伤的干预及机制

目的建立大鼠丙烯酰胺(Acrylamide,ACR)神经中毒模型和钙蛋白酶抑制剂Calpeptin(CP)干预模型,探讨CP对ACR诱导的大脑微管(Microtubules,MT)损伤的干预作用及其机制,以期为ACR诱导的神经损伤提供预防与治疗的理论依据。方法将40只SPF级雌性Wistar大鼠随机分为对照组、CP组、ACR组和ACR+CP组,每组10只。采用腹腔注射进行ACR染毒和CP干预,对照组给予生理盐水;CP组给予200μg/kg CP;ACR组给予30 mg/kg ACR;ACR+CP组在给予30 mg/kg ACR后1 h,给予200μg/kg CP进行干预。每周3次,共4周。每周末进行大鼠体重、步态评分和转棒试验测定。处理结束后,迅速分离大脑组织,测定钙蛋白酶Calpain的活力,采用凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹法(Western blot)分析α-tubulin、β-tubulin、CDK5、p25和p35蛋白的含量。结果与对照组相比,ACR组自第三周开始步态评分升高、转棒试验停留时间缩短(P<0.05);与ACR组相比,ACR+CP组上述变化均有所改善(P<0.05)。至实验结束时与对照组相比,ACR组Calpain活力升高了59.86%(P<0.05);与ACR组相比,ACR+CP组Calpain活力降低了32.80%(P<0.05)。与对照组相比,CP组CDK5和p35的含量呈现升高趋势,分别升高了31.01%和19.06%(P<0.05),ACR组α-tubulin、β-tubulin、CDK5、p25和p35分别升高了12.63%、21.14%、52.81%、40.58%和25.05%(P<0.05),ACR+CP组CDK5和p35的含量呈现升高趋势,分别升高了42.80%和22.60%(P<0.05)。与ACR组相比,ACR+CP组α-tubulin、β-tubulin、CDK5、p25和p35分别降低了13.10%、10.96%、6.55%、12.79%和25.65%(P<0.05)。结论 CP对ACR诱导的MT损伤具有干预作用,其机制可能是CP通过Calpain调节p35-CDK5/p25通路来维持MT的稳定性。