两株海南省恶性疟原虫gp195的脱氧核糖核酸序列分析

用聚合酶链反应(PCR)法扩增两株海南省恶性疟原虫gp195的第二区,并用dd NTP链终止法测得154个氨基酸序列。实验结果表明:海南省FCC7801/HN的B3克隆及FCCM21/HN两株此区序列完全相同,与巴布亚新几内亚MAD20株很相近,但有10个氨基酸的位点有区别。

恶性疟原虫红内期疫苗的研究现状和展望

恶性疟原虫红内期疫苗的研究现状和展望管惟滨，孙树权（上海第二军医大学寄生虫学教研室，上海２００４３３）疟疾仍然是当今人类最主要的传染病之一，全球每年约有一亿二千万疟疾患者，带虫者达三亿。由于疟原虫的抗药性和媒介按蚊对杀虫剂也产生抗性，因此常用的药物防...

疟疾红内期疫苗

疟疾依然是严重危害人类健康的媒介传染病,其病原体是一种单细胞的原虫-疟原虫,以按蚊为传播媒介.

中国脑型疟患者恶性疟原虫分离株裂殖子表面蛋白MSP1第16-17区基因和MSP2基因的分子克隆与鉴定

目的 :为设计研制安全有效的人脑型疟疫苗提供理论依据。方法 :根据 MAD2 0株裂殖子表面蛋白 1( MSP1)和 FC2 7株裂殖子表面蛋白 2 ( MSP2 )基因编码区高度保守碱基设计并合成两对引物 ,应用多聚酶链反应 ( PCR)技术对 5例脑型疟患者恶性疟原虫云南省勐腊县勐罕分离株 CMH/ YN和云南省盈江县农场 CYJ/ YN分离株基因组 DNA MSP1第 13- 17区基因和MSP2基因进行扩增 ,并将扩增产物分别经 Eco RI和 Kpn I,Bam HI和 Hind III双酶切后 ,分子定向克隆 M13mp18和 M13mp19载体 ,转染大肠杆菌 ( E.coli) TG1,从含 X- gal和 IPTG的 LB平板上 ,将随机筛选得到的单个无色噬菌斑经 E.coli JM10 3扩增 ,用碱裂解法抽提重组子复制型DNA ( RFDNA)后 ,再分别经 Eco RI和 Kpn I,Bam HI和 Hind III双酶切鉴定。结果 :证实重组子为编码脑型疟患者恶性疟原虫 CMH/ YN和 CYJ/ YN分离株 MSP1第 16- 17区基因和 MSP2基因分子克隆 M13载体。结论 :首次报道确证脑型疟患者恶性疟原虫 CMH/ YN和 CYJ/ YN分离株MSP1第 16- 17区基因和 MSP2基因分别与 MAD2 0株 MSP1和 FC2 7株 MSP2相应基因完全一致。这些发现对研究预防人脑型疟疫苗和建立一种新型脑型疟恶性疟原虫检测方法具有重要意义。

聚合酶链反应用于恶性疟疾诊断初步研究

合成一对恶性疟原虫特异引物，用聚合酶链的反应（PCR）技术检测海南岛恶性疟病人滤纸血滴30例，结果28例阳性，在206bp处可见一条清晰易辨的扩增条带，2例阴性经血片复查，其中1例为间日疟原虫；同时检测间日疟病人血滴和未发现原虫的发热病人血滴各16例，均为阴性，与镜检符合率达98．4％（61／62例）。初步表明PCR法具有准确、敏感、特异、简捷等优点，采用滤纸血滴方便现场采样、保存和送检，且易批量检测，在疟疾临床诊断和流行病学调查方面，将可替代血片镜检法，逐步扩大应用。

间日疟原虫环子孢子蛋白和裂殖子表面抗原的多态性

虽然恶性疟原虫疫苗抗原研究取得了较大进展，目前已制备出许多恶性疟原虫期特异性抗原［１］，但间日疟原虫的研究因不能体外培养而受限制。本文将主要描述至今已特征化了的两种间日疟原虫候选疫苗抗原：环子孢子蛋白和裂殖子表面抗原－１。为了资料的完整性和选择性，本...

PCR扩增环子孢子蛋白基因3' 端片段用于检测恶性疟原虫的初步研究

目的 :建立 PCR检测恶性疟原虫的新方法。方法 :作者采用自行设计并合成的一对恶性疟原虫特异引物 ,经 PCR扩增环子孢子蛋白 ( CSP)基因 3 端保守区序列 2 4 5bp片段 ,观察了它的特异性、敏感性和稳定性。结果 :1从 4株培养的恶性疟原虫和 2例恶性疟患者血样中均扩增出约 2 4 5bp的 DNA目的片段 ,用业已鉴定的 CSP基因序列作模板再行扩增证实其为恶性疟原虫CSP基因片段 ;2对间日疟原虫、利什曼原虫、弓形虫和健康人血样进行 PCR反应 ,均未见扩增条带 ;3本检测系统可检出恶性疟原虫感染血样中 0 .18个原虫所含的 DNA模板 ;4采用不同方法制备模板及不同反应方式均能获得满意结果 ;结论 :PCR扩增恶性疟原虫 CSP基因 3 端片段用于恶性疟原虫检测具有灵敏、高度特异且稳定性好等优点。

恶性疟原虫杂合45肽抗原与乙肝病毒表面抗原融合基因在酵母中表达

通过ＰＣＲ扩增ＨＢｓＡｇ基因的Ｓ片段，然后将Ｓ基因与恶性疟原虫杂合４５肽基因连接并克隆到酵母表达质粒ｐＹＥＵｒａ３上。重组质粒被转化到酵母受体菌中。融合基因在酵母中获得表达，表达产物ＨＢｓＡｇ／４５肽，该融合蛋白经亲合层析后被纯化。电镜观察到ＨＢｓＡｇ／４５肽呈颗粒状。

核酸免疫及其在寄生虫学领域中的应用

核酸免疫是一项新的疫苗研究技术，动物实验研究结果表明，它能全面诱导机体的体液和细胞免疫应答，显示出引人注目的应用前景。本文对核酸免疫的产生、在寄生虫病和传染病免疫预防中的应用研究近况及其优点等作简单介绍。现代免疫学研究证明，抗原进入机体引起免疫反应有...

伯氏疟原虫的浓集和纯化

在进行疟原虫生物化学、免疫学及分子生物学研究时,疟原虫样品中宿主成分的污染常会影响实验结果。因此需要分离纯净的疟原虫作为实验材料。分离的方法有聚蔗糖、泛影葡胺及明胶溶液法。近年认为Percoll溶液是首选的分离介质,然而该液昂贵,需进口。

中国脑型疟患者恶性疟原虫分离株裂殖子表面蛋白MSP1第16—17区基因的分子克隆及序列分析

目的 :为设计研制安全有效的人脑型疟疫苗提供进一步科学依据。方法 :应用多聚酶链反应 ( PCR)技术对中国 5例脑型疟患者恶性疟原虫云南省勐腊县勐罕 CMH/YN分离株和云南省盈江县农场 CYJ/YN分离株基因组 DNA裂殖子表面蛋白 1( MSP1)第 13— 17区基因进行扩增 ,将扩增产物分别经 Eco RI和 Kpn I双酶切后 ,回收的 MSP1第 16— 17区基因分子定向克隆M13mp18和 M13mp19载体 ,按 Sanger双脱氧链终止法进行 DNA序列测定 ,并与 MAD2 0、K1和Wellcome株原型基因进行同源性分析比较。结果 :发现脑型疟患者恶性疟原虫 CMH/YN和 CYJ/YN分离株 MSP1第 16— 17区基因之间的序列完全相同 ,全长为 918bp,编码 30 6个氨基酸 ,含 12个半胱氨酸组成的 2个表皮生长因子 ( EGF)单体结构域 ;除了在核苷酸第 4 869位缺失 1个碱基和散在分布 5个碱基点突变之外 ,与 MAD2 0、K1和 Wellcome株相应基因之间的核苷酸同源性分别为 98.6%、2 3.3%和 2 2 .8%。结论 :本研究在世界上首次报道脑型疟患者恶性疟原虫分离株MSP1第 16— 17区 DNA序列测定分析结果 ,确证该基因与 MAD2 0株高度同源性 ,并发现在1691— 170 1位氨基酸存在 TCTEEDSGSSR表位。

恶性疟原虫的克隆化及克隆株某些生物学特性的初步观察

本实验用有限稀释法对海南省两株恶性疟原虫Fcc-1、Fcc-7801进行了体外克隆,共得8个疟原虫克隆。不同克隆对氯喹的敏感性相差显著,对英国抗gp195单克隆抗体、我国抗Fcc-1杂交瘤腹水的间接免疫荧光反应也有显著差异。对抗gp195单克隆抗体的反应表现具有5种类型,其中3种与McBride划分的7种血清型中的Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ型相一致。

含恶性疟原虫基因片段的重组减毒鼠伤寒杆菌的免疫效果

减毒鼠伤寒杆菌可被用作外源抗原基因经口导入宿主免疫系统的载体,能有效地激发起宿主针对该外源抗原的免疫应答反应.恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1(merozoite surfaceprotein 1,MSP1)是恶性疟原虫红内期的重要候选抗原.我们已成功地将克隆有恶性疟原虫MSP1第1号基因片段(M1)的pQE质粒导入了减毒鼠伤寒杆菌x4064株中,构建成x4064(pQEM1)重组菌,测定了其在小鼠体内的稳定性.本文就X4064(pQEM1)重组菌接种小鼠后所激发的针对M1蛋白的免疫应答进行了初步的检测.

两种恶性疟原虫复合抗原免疫血清对疟原虫体外抑制作用的比较

为了比较恶性疟原虫复合抗原HBsAg/45肽和β-半乳糖苷酶/45肽的免疫效果,我们将这两种含45肽抗原的融合蛋白免疫家兔后进行体外抑制试验。结果表明颗粒状的HBsAg/45肽免疫血清对原虫的抑制作用明显大于线状的β-半乳糖苷酶/45肽免疫血清。提示:恶性疟原虫杂合45肽连于HBsAg颗粒上有助于提高其免疫保护作用。

银染法观察胶体金标记的恶性疟原虫裂殖子表面主要蛋白与人红细胞的结合作用

恶性疟原虫裂殖子表面主要蛋白－１，又称Ｐ１９５，与人红细胞膜具有结合作用，这种结合是裂殖子识别红细胞的基础。为了确定Ｐ１９５蛋白与人红细胞的结合位点，我们在大肠杆菌中分８段表达了Ｐ１９５蛋白。各段表达蛋白经过提纯与复性后，用胶体金标记。标记后的各段蛋白分别与人红细胞共孵育。然后将此红细胞加入到银显影液中。结果发现，红细胞在与一段Ｐ１９５蛋白（Ｍ６，氨基酸序列为３８４－５９５）共孵育并加入到银显影液中后，红细胞表面出现黑色银沉淀。而红细胞在与其它各段Ｐ１９５蛋白进行同样操作后，红细胞表面没有出现黑色银沉淀。这表明经胶体金标记后的Ｍ６与人红细胞具有结合作用。Ｍ６所对应的区域可能就是Ｐ１９５蛋白的红细胞结合区域。

疟原虫的抗原变异

疟疾是一种严重危害人类健康的寄生虫病。近年来,疟原虫抗药性及蚊媒耐药性的产生和扩散,促使人们重新考虑用疫苗控制疟疾。然而疟疾获得性免疫具有显著的虫株特异性,提示疟原虫抗原存在虫株变异。这给抗疟疫苗研制带来严重困难。因此,深入阐明疟原虫抗原变异规律。

克隆有恶性疟原虫MSP1基因片断的pQE质粒在减毒鼠伤寒杆菌X4064株中的表达

为探讨克隆有恶性疟原虫ＭＳＰ１基因片断的重组ｐＱＥＭ１质粒在减毒鼠伤寒杆菌中的表达。使用转化和转导的方法构建减毒鼠伤寒杆菌Ｘ４０６４（ｐＲＥＰ４／ｐＱＥＭ１）；通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检测减毒鼠伤寒杆菌Ｘ４０６４（ｐＱＥＭ１）和减毒鼠伤寒杆菌Ｘ４０６４（ｐＲＥＰ４／ｐＱＥＭ１）的表达。实验结果成功地构建了减毒鼠伤寒杆菌Ｘ４０６４（ｐＱＥＭ１），Ｘ４０６４（ｐＲＥＰ４／ｐＱＥＭ１）的诱导型表达量高于Ｘ４０６４（ｐＱＥＭ１）的组成型表达量。

磺化标记的DNA探针用于检测恶性疟感染的评价

采用非同位素磺化修饰法(sulfomodification),标记恶性疟原虫DNA重组质粒片段pPF14。用此探针,以斑点杂交试验检测恶性疟原虫感染,并和常规血片法进行比较。结果显示:对于体外培养的恶性疟原虫,该法可检出25 pg纯化的DNA,或0.001％的原虫率。探针和人白细胞、鼠伯氏疟原虫、约氏疟原虫DNA均无交叉反应。对179份云南省西双版纳自治州疟疾病人血样进行检测,探针法结果和血片法有较好的相关性,探针法检测恶性疟的符合率为92.5％(99/107),和间日疟的交叉反应率为1.39％(1/72),和48例正常人血无一交叉反应。

用单克隆抗体鉴定恶性疟原虫裂殖子表面抗原

用海南省恶性疟原虫Fcc7801/HN作为抗原,制备的抗恶性疟原虫单克隆抗体C6株具有明显的抑制体外恶性疟原虫生长的作用,并且与恶性疟原虫Fcc-1/HN,Fcc7802/HN,Fcc8703/JS和伯氏疟原虫、食蟹猴疟原虫有较广泛的交叉免疫荧光反应。用免疫电镜观察,此株单克隆抗体能识别恶性疟原虫裂殖子表面抗原,用免疫印迹法测得该抗原分子量为71kDa,此抗原有可能成为疟疾疫苗的候选抗原。

用胶体金标记法观察P195蛋白与人红细胞特异性结合区域

目的：寻找恶性疟原虫裂殖子表面主要蛋白Ｐ１９５中的红细胞结合位点，为设计疫苗阻断裂殖子入侵人红细胞提供实验依据。方法：在大肠杆菌中分８段表达Ｐ１９５蛋白，用镍亲和层析柱分离这些蛋白。各段蛋白经复性后用胶体金标记。标记后的蛋白与人红细胞共孵育，经固定、切片后在电镜下观察。同时将各段蛋白加入到体外培养的人恶性疟原虫的培养基上清中，观察各段蛋白对裂殖子入侵红细胞的影响。结果：Ｐ１９５蛋白中的一段，即Ｍ６（氨基酸序列３８４～５９５）具有红细胞结合作用。Ｍ６的胶体金复合物不能与经胰酶和神经氨酸酶处理过的红细胞发生结合。Ｍ６还能抑制裂殖子入侵红细胞。结论：Ｐ１９５的一段区域（Ｍ６）具有唾液酸残基依赖性红细胞结合作用，它可能是恶性疟原虫裂殖子识别人红细胞的“标志”。