评估日本血吸虫病免疫学诊断方法疗效考核价值的合作研究

本项合作研究有12个单位的14个测试系统,采用450份血清进行双盲法测试,用经典抗体检测方法SEA/ELISA作为对照.检测结果显示,有6种测试系统相对较好,已超过或接近经典抗体检测方法,并对今后我国血吸虫病诊断研究提出意见.

循环抗原检测进一步研究的初步设想

卫生部于1993年5月18日～24日在岳阳举行了血吸虫病循环抗原检测研讨会.8个单位参试了血吸虫循环抗原(CAg)检测方法,一些专家对当前CAg检测中的问题进行了分析。

日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30的建株及初步鉴定

用感染8条日本血吸虫尾蚴,时间长达一年半的BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用兔抗日本血吸虫肠相关抗原和兔抗可溶性虫卵抗原免疫血清与细胞培养上清进行ELISA筛选阳性克隆,最终建立了分泌单克隆抗独特型抗体细胞株NP30。作者用一系列试验证明,NP-30是日本血吸虫肠相关抗原的内影象抗独特型抗体,有替代日本血吸虫虫源性抗原用于血清学诊断的可能性。

中药用于血吸虫病抗独特型抗体疫苗佐剂的研究

目的 从中药中筛选血吸虫病抗独特型抗体疫苗的佐剂 ,并初步探讨其作用机制。方法 日本血吸虫抗独特型抗体 NP30主动免疫 BAL B/ c小鼠 ,分别联用虫草多糖、猪苓多糖、黄芪、甘草酸和人体免疫调理剂 (HIM) ,观察其对小鼠的保护作用 ,并检测小鼠血清特异性 Ig G、Ig G1和 Ig G2 a抗体水平。结果 黄芪和 HIM能明显提高 NP30对小鼠的保护性免疫作用 ,减虫率显著提高 ,从单用 NP30的 37.8%分别提高到 5 0 .6 %和 5 3.6 % ;但两者对血清特异性 Ig G、Ig G1和 Ig G2 a抗体均无明显升高作用。结论 黄芪和 HIM可明显提高血吸虫病抗独特型抗体疫苗 NP30的保护性免疫力 ,可作为 NP30的佐剂 ,其佐剂作用与所检测的抗体水平似不相关 ,推测可能与细胞免疫应答有关。

钙纳米颗粒作为血吸虫病抗独特型抗体疫苗佐剂的研究

目的 探索钙 (Ca)纳米颗粒作为日本血吸虫病抗独特型抗体 NP30疫苗佐剂的可行性。方法 将钙纳米颗粒与 NP30制备成 Ca- NP30结合物 (Ca- NP30 ) ,主动免疫 BAL B/ c小鼠 ,观察其对小鼠的保护性作用并探讨其免疫保护机制。结果 Ca纳米颗粒可增强 NP30对宿主的保护性作用 ,减虫率明显提高 ,从单用 NP30的 30 .4%提高到 5 7.8% ;血清特异性抗体 Ig G水平较对照组显著升高 ;足垫试验可引发迟发型变态反应。结论 Ca纳米颗粒可作为血吸虫病抗独特型抗体 NP30疫苗的佐剂 ,其作用机制与同时引起宿主体液免疫和细胞免疫应答增强有关。

用噬菌体肽库筛选SjC-TPI的模拟抗原表位

目的 筛选日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶 (SjC TPI)分子的模拟抗原表位 ,研究其免疫学特性。方法 用纯化的抗重组SjC TPI抗体 (IgG)筛选 12肽库 ,获取SjC TPI的模拟抗原表位 ,并研究其抗原特性。结果 获得SjC TPI分子的两个模拟抗原表位M1和M2 ,Westernblotting分析结果表明由这两个模拟抗原表位免疫小鼠产生的免疫血清能识别SjC TPI分子和含此两抗原表位的噬菌体外壳蛋白。DNA测序结果显示这两个模拟抗原表位的氨基酸序列与SjC TPI无同源性。结论 本研究获得的模拟抗原表位M1及M2为SjC TPI的空间构型抗原的模拟表位 。

氯硝柳胺悬浮剂浸杀钉螺螺卵和幼螺效果的研究

目的了解氯硝柳胺悬浮剂(SCN)杀灭钉螺螺卵、幼螺等不同生长发育阶段的效果。方法分别称取SCN和氯硝柳胺乙醇胺盐可湿性粉剂(WPN),采用实验室螺卵、幼螺浸杀法,并比较两者对杀灭螺卵和幼螺的不同效果。结果SCN0.25mg/L浸杀螺卵24h,螺卵死亡率为100%;WPN0.50mg/L浸杀24h,螺卵死亡率为100%。SCN浸杀螺卵24、48、72h的LC50值分别为0.0506、0.0496、0.0473mg/L;WPN浸杀螺卵24、48、72h的LC50值分别为0.1030、0.0962、0.0869mg/L。SCN和WPN0.25mg/L浸杀幼螺死亡率均为100%;SCN浸杀幼螺24、48、72h的LC50值分别为0.0625、0.0474、0.0442mg/L;WPN浸杀幼螺24、48、72h的LC50值分别为0.1088、0.0825、0.0825mg/L。结论氯硝柳胺悬浮剂对钉螺螺卵、幼螺均具有较好的杀灭作用。

用单克隆抗独特型抗体NP30检测血吸虫病短程抗体的研究

为证实用日本血吸虫单克隆抗独特型抗体ＮＰ３０制备的抗体检测试剂盒考核治疗效果的价值，采用双“抗原”夹心酶联免疫吸附试验，用ＮＰ３０替代抗原，检测血吸虫病抗体。结果：该试剂盒对急性感染者的检出率为１００％，慢性轻度感染者的检出率为６１％，特异性为１００％。急性感染和慢性感染的Ｙｏｕｄｅｎ指数（ｒ）分别为１．０和０．６１，慢性感染者与经典抗体检测法ＳＥＡ／ＥＬＩＳＡ（０．６０）的ｒ无差别。用此试剂盒检测血吸虫病治疗后１ａ的血清，阴转率达１００％，明显优于经典抗体检测法（４３．６％）。结论：ＮＰ３０检测的抗血吸虫抗体属短程抗体，该试剂盒具有与循环抗原检测相同的考核疗效价值。

重组IL-2、IL-6、TNF-α作为血吸虫病疫苗佐剂的研究

目的 观察重组 IL-2、IL-6和 TNF-α(r IL-2 ,r IL-6,r TNF-α)作为血吸虫病抗独特型抗体疫苗佐剂的可行性 ,并探讨其作用机制。方法 日本血吸虫抗独特型抗体 NP3 0主动免疫BAL B/c小鼠 ,分别联用 r IL-2、r IL-6和 r TNF-α,观察其对小鼠的保护性免疫作用 ,以及对宿主体液免疫和细胞免疫的影响。结果 r IL-2和 r IL -6能明显提高 NP3 0疫苗对小鼠宿主的保护性作用 ,减虫率和减卵率均明显提高 ,减虫率从单用 NP3 0的 40 .6%分别提高到 5 3 .5 %和 5 5 .7% ,减卵率从 46.5 %分别提高到 68.7%和 69.8% :二者均使血清特异性 Ig G、Ig G1和 Ig G2 a抗体明显升高 ;另外 ,足垫试验结果显示 NP3 0加用 r IL -2可引发迟发型变态反应。 r TNF -α无增强 NP3 0的保护性免疫作用。结论 r IL -2和 r IL -6可作为血吸虫病抗独特型抗体疫苗的佐剂 ,其作用机制与同时增强 Th1和

重组日本血吸虫中国大陆株rTPI分子对小鼠免疫保护性作用的研究

目的研究重组日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶（SjC－TPI）分子抗血吸虫感染的保护性作用。方法用IPTG诱导表达，制备纯化的重组TPI蛋白，将重组TPI抗原免疫C57BL／6及昆明鼠，8周后用血吸虫尾蚴攻击感染，45d后剖杀，计数减虫率及减卵率。结果C57BL／6获得27．78％的减虫率；昆明鼠获得21．39％的减虫率，54．00％的减卵率。结论重组SjC－TPI对血吸虫感染具有一定的保护作用，可能为日本血吸虫病疫苗候选分子之一。

卵黄抗体IgY检测血吸虫病人循环抗原的初步研究

目的探讨抗可溶性虫卵抗原(SEA)卵黄抗体(IgY)检测血吸虫循环抗原的应用价值。方法以纯化的鸡IgY作为捕捉抗体,以酶标抗SEA单克隆抗体NP28-5B为检测抗体的双抗体夹心酶联免疫吸附试验法(S-ELISA)检测急、慢性血吸虫病人和健康人血清,并与常规检测抗体的酶联免疫吸附试验法(SEA-ELISA)作比较。结果S-ELISA测得SEA浓度(y)与吸光度(A450)值(x)呈明显的正相关(y=459.22x-108.14,r=0.9481)。急性血吸虫病人循环抗原的阳性率为100.00%(9/9),慢性血吸虫病人循环抗原的阳性率为84.44%(38/45),健康人的特异性为96.00%(48/50)。两种方法对血吸虫病的检出率差异无统计学意义(P>0.05)。结论S-ELISA具有较好的敏感性和特异性,可用于血吸虫病免疫诊断。

快速胶体染料试纸条法检测弓形虫病IgM抗体的研究

目的 研制一种检测弓形虫病Ig M抗体的快速胶体染料试纸条法(DDIA) ,与国外进口试剂盒进行比较,以评价其临床应用价值。方法 以本实验室筛选的胶体染料D- 1标记兔抗人Ig M,以此标记物与弓形虫病人血清中的抗弓形虫Ig M抗体结合,用点有弓形虫可溶性抗原的硝酸纤维膜通过层析捕获染料标记兔抗人Ig M与弓形虫Ig M抗体的复合物,采用正交试验确定DDIA的最佳检测条件;对2 5份弓形虫Ig M抗体阳性血清和5 0份正常人血清进行检测;同时对弓形虫病流行病学筛查时的84份血清进行检测并与进口试剂盒的检测结果进行比较。结果 DDIA的最佳检测条件为:弓形虫可溶性抗原的点膜浓度为1mg/ m l,血清用量为10μl和兔抗人Ig M胶体染料检测液作1∶2 0稀释时的检测带清晰且背景较浅;2 5份弓形虫Ig M抗体阳性血清均为阳性,5 0份正常人血清有3份为Ig M抗体阳性;DDIA与进口试剂盒的总符合率为97.6 % ,其中阳性和阴性符合率分别为10 0 .0 % (35 / 35 )和95 .9% (47/ 4 9)。结论 DDIA简便快速,有较好的敏感性和特异性,同时与进口试剂盒有较高的符合率,表明该法具有较高的弓形虫病诊断价值。

日本血吸虫多价DNA疫苗的构建及鉴定

目的构建含日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶(TPI)基因和日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30H链CDR3区6倍重复表位基因(CDR3)6的多价DNA疫苗,并观察该融合基因在真核细胞中表达。方法设计合成连接肽(Gly4Ser)3基因的两条互补单链,退火成双链后克隆到真核表达载体pcDNA3.1,改建为pcDNA3.1-linker。分别将SjCTPIDNA片段及NP30的(CDR3)6DNA片段克隆到连接肽的上游或下游,构建pcDNA3.1-TPI-linker-(CDR3)6和pcD-NA3.1-(CDR3)6-linker-TPI2种多价疫苗。设计引物分别扩增TPI-linker-(CDR3)6和(CDR3)6-linker-TPI,再分别插入真核表达载体pEGFP-N1多克隆位点,绿色荧光蛋白基因的上游,重组质粒用脂质体导入真核细胞COS-7,观察插入基因在真核细胞的表达。结果经双酶切及测序鉴定证实多价疫苗pcDNA3.1-TPI-linker-(CDR3)6和pcDNA3.1-(CDR3)6-linker-TPI构建成功;构建的pEGFP-N1-TPI-linker-(CDR3)6和pEGFP-N1-(CDR3)6-linker-TPI在导入COS-7细胞后能成功表达。结论日本血吸虫TPI和NP30-(CDR3)6的多价DNA疫苗构建成功,且该融合基因能在真核细胞中表达。

抗独特型抗体NP30对血吸虫病虫卵肉芽肿及肝纤维化的调节作用

目的 研究单克隆抗独特型抗体NP30主动免疫对血吸虫病虫卵肉芽肿及肝纤维化的影响。方法 实验组ICR小鼠腹腔注射NP30 10 0 μg/次 ,连续免疫 3次 ,对照组腹腔注射SP2 / 0腹水。尾蚴攻击感染后第 4、8、12、16、2 0和 2 4周分别处死小鼠剖取肝脏 ,用VG(VanGieson)组织化学染色 ,Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和纤维连接蛋白 (FN)免疫组织化学染色 ,应用计算机图像分析系统对肝脏虫卵肉芽肿体积和虫卵肉芽肿内的胶原沉积进行定量测定。结果 尾蚴攻击感染第 12周后 ,实验组虫卵肉芽肿的体积明显小于对照组 ,虫卵肉芽肿细胞组分与对照组明显不同 ,出现两种不典型肉芽肿。VG染色显示实验组虫卵肉芽肿内胶原的平均光密度值明显小于对照组。免疫组织化学显示实验组虫卵肉芽肿内Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原及FN含量均比对照组低。结论 NP30接种可能诱导体液和细胞两种保护性免疫 ,对血吸虫病虫卵肉芽肿具有负调节作用 。

日本血吸虫鸡尾酒式DNA疫苗与蛋白疫苗联合应用增强免疫保护作用的研究

目的探讨日本血吸虫鸡尾酒式DNA疫苗与蛋白疫苗联合应用以增强免疫保护作用的效果。方法分别大量制备质粒DNA:pcDNA3.1-SjC23、pcDNA3.1-SjCTPI、pcDNA3.1-(CDR3)6和重组蛋白SjC23-HD、SjCTPI、NP30。pcDNA3.1-SjC23、pcDNA3.1-SjCTPI、pcDNA3.1-(CDR3)6等量混合后即为鸡尾酒式的混合DNA疫苗,重组蛋白SjC23-HD、SjCTPI、NP30等量混合后即为鸡尾酒式的混合蛋白疫苗。70只BALB/c小鼠随机分为A、B、C、D、E5组,每组14只。A组为自然感染组;B组(空质粒对照组)每只小鼠分别在第0、3、6周经股四头肌注射100μlpcDNA3.1;C组(空质粒+混合蛋白对照组)每只小鼠分别在第0、3、6周经股四头肌注射100μlpcDNA3.1,第9周每鼠经背部皮下多点注射100μl混合蛋白疫苗+100μl福氏完全佐剂(FCA);D组(混合DNA组)每只小鼠分别在第0、3、6周经股四头肌注射100μl混合DNA疫苗;E组(混合DNA+混合蛋白组)每只小鼠分别在第0、3、6周经股四头肌注射100μl混合DNA疫苗,第9周每鼠经背部皮下多点注射100μl混合蛋白疫苗+100μlFCA。DNA免疫组末次免疫后4周,蛋白加强组末次免疫后2周,所有小鼠同时经腹部皮肤感染(40±1)条尾蚴。攻击感染后42d剖杀小鼠,计数成虫及肝脏虫卵数。首次免疫前2d及感染前2d分别经尾静脉采血,分离血清检测IgG抗体水平、抗体亚类IgG1及IgG2a,并取小鼠脾脏制备单个脾细胞,检测细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ的水平。结果C、D组和E组的减虫率分别为17.70%、32.88%和45.35%,D组和E组的减虫率均显著高于C组(P均<0.01),且E组的减虫率显著高于D组(P<0.01);C、D组和E组的减卵率分别为9.39%、36.20%和48.54%,D组和E组的减卵率均显著高于C组(P均<0.01),且E组的减虫率也显著高于D组(P<0.05)。C、D、E3组小鼠血清都检测到特异性IgG抗体,抗体亚类IgG2a/IgG1比值分别为0.525、1.829、0.712。D、E两组小鼠IL-2、IFN-γ含量较空质粒对照组均有明显升高,IL-4则无明显差异。结论混合DNA疫苗和混合蛋白疫苗联合应用具有一定的正协同作用,混合蛋白疫苗可显著增强混合DNA疫苗的免疫保护作用。

日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30对虫卵肉芽肿免疫调节作用的研究

目的研究日本血吸虫单克隆抗独特型抗体ＮＰ３０对虫卵肉芽肿的影响。方法 ＮＰ３０腹腔注射主动免疫ＩＣＲ小鼠，对照组腹腔注射ＳＰ２／０腹水，分别在尾蚴攻击感染后第４、８、１２、１６、２０、２４周处死，观察和比较肝内虫卵肉芽肿的形成和演变。应用计算机图像分析技术，测量虫卵肉芽肿大小。结果尾蚴攻击感染第 １２周以后， ＮＰ３０免疫组虫卵肉芽肿的直径明显低于 ＳＰ２／０对照组，虫卵肉芽肿的演变时相提前，并出现２种特殊类型的肉芽肿。结论ＮＰ３０能减轻日本血吸虫对宿主造成的免疫病理损害。

抗弓形虫靶向抗菌肽的构建及其效应的初步评价

目的构建弓形虫主要表面抗原1单链抗体S1与爪蟾抗菌肽(magainin)的融合基因,在大肠杆菌中诱导表达,观察纯化的靶向抗菌蛋白抗弓形虫感染的效果。方法根据弓形虫主要表面抗原1单链抗体S1的编码序列设计引物从噬菌粒S1/pIT-2中扩增到S1基因;以其为模板,加入接头抗菌肽序列,采用重叠PCR法扩增得到S1基因与爪蟾抗菌肽的融合基因(S1M),将其克隆到原核表达载体pET-32c中,构建成S1与爪蟾抗菌肽基因的重组表达质粒S1M/pET-32c;测序验证后转化E.coliBL21,以IPTG诱导表达,用Ni2+螯合柱亲和纯化融合蛋白S1M,SDS-PAGE检测融合基因的表达和纯化的融合蛋白S1M;分别采用体内和体外试验观察纯化的靶向抗菌蛋白抗弓形虫感染效果。结果测序结果表明,成功地将弓形虫主要表面抗原1单链抗体S1与爪蟾抗菌肽的融合基因构建到原核表达载体pET-32c中;SDS-PAGE显示IPTG诱导表达的融合蛋白S1M大小约为43kDa,与预期的大小相一致,以包涵体的形式存在;通过变性条件下Ni2+亲和柱纯化获得S1M重组融合蛋白;体内和体外试验证实,经靶向抗菌蛋白处理过的弓形虫对小鼠的致病能力下降,应用靶向抗菌蛋白的弓形虫感染小鼠的存活时间与对照组相比有明显的提高。结论以抗弓形虫速殖子人源单链抗体作为靶向分子,以爪蟾抗菌肽作为效应分子,构建成功的靶向抗菌蛋白通过体内、外试验证实,具有一定的抗弓形虫感染的作用,虽然还不能完全杀灭弓形虫,但是在弓形虫生物治疗药物的研制方面进行了有益的探索,为弓形虫病的生物治疗提供了新的思路。

转基因CHO细胞中VMAT_2抗毒性作用的研究

目的 研究转基因中国仓鼠卵 (CHO)细胞中单胺囊泡转运体 (VMAT2 )的抗毒性作用。方法 利用转 PC1 2 细胞基因到 CHO细胞中形成的转基因 CHO细胞 (c DNACHO) ,采用 MTT比色法检测 1-甲基 -4 -苯基吡啶离子 (MPP+ )对 CHO细胞野生株 (wt CHO)和 c DNACHO细胞的毒性作用 ,并观察利血平——VMAT2 的特异性阻滞剂对 MPP+毒性作用的影响。结果 在 MPP+ 0 .5 m mol/ L 以上浓度 c DNACHO细胞对 MPP+ 敏感性比 wt CHO低得多 ;c DNACHO和 wt CHO对鱼藤酮 (rotenon)的敏感性无显著差异 ;加入VMAT2 的特异性阻滞剂利血平后 ,上述保护作用消失 ,c DNACHO对 MPP+ 敏感性与 wt CHO细胞无差异 ,而单独予以 wt CHO细胞利血平则不能改变它对低浓度 MPP+的敏感性。结论 此保护机制是由转基因细胞中 VMAT2 引起的 ,VMAT2 在转基因的非神经细胞系 (CHO细胞系 )中也能将 MPP+转运至囊泡内 ,从而保护细胞 ;同时也提示 PC1 2

日本血吸虫多价DNA疫苗免疫保护作用的研究

目的研究日本血吸虫多价DNA疫苗诱导BALB/c小鼠的免疫保护作用。方法65只BALB/c雌性小鼠随机分为5组,各组小鼠分别肌肉注射纯化的质粒DNApcDNA3.1(对照组)、pcDNA3.1-TPI(TPI)、pcDNA3.1-(CDR3)6[(CDR3)6]、pcDNA3.1-TPI-linker-(CDR3)6(TLC)和pcDNA3.1-(CDR3)6-linker-TPI(CLT),每鼠100μg。每隔2周加强免疫1次,共3次。末次免疫后4周每鼠经腹部皮肤攻击感染(45±1)条日本血吸虫尾蚴,45d后剖杀,计数成虫及肝脏虫卵数。首次免疫前2天及感染前2天经尾静脉采血检测IgG抗体水平、抗体亚类IgG1、IgG2a。末次免疫后2周取小鼠脾脏制备单个脾细胞,检测细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ的水平。结果TPI、TLC组和CLT组小鼠血清都检测到特异性IgG抗体,抗体亚类IgG2a/IgG1的比值分别为1.71、2.71和4.70,而其他两组则未检测到特异性IgG抗体;TPI、TLC组和CLT组小鼠的IL-2、IFN-γ较对照组均有不同程度的升高,IL-4则无明显差异。多价DNA疫苗TLC组和CLT组减虫率分别达到37.30%、39.09%,减卵率分别为41.61%、49.54%,均显著高于TPI组和(CDR3)6组(P均<0.05)。结论多价DNA疫苗相对于单价DNA疫苗能诱导小鼠产生较高的免疫保护作用,且诱导宿主产生较高的以Th1为主的免疫应答。

高亲和力抗Met人源基因工程抗体scFv的筛选与特性分析

目的应用噬菌体展示技术制备抗HGF受体Met特异性、高亲和力的全人抗体scFv片段。方法以从天然抗体库中筛选出的Fab基因可变区VH和VL为模板,分别在CDR区引入有限突变和随机突变,扩增出scFv基因库,克隆于pComb3XSS中,构建scFv次级突变抗体库,筛选高亲和力克隆。结果经5轮细胞筛选和2轮抗原固相筛选,选取60个克隆进行ELISA检测,选择较高亲和力的噬菌体抗体,克隆于原核表达载体pBAD-gIII/A中,经诱导表达、SDS-PAGE和Westernblotting分析,在相对分子质量30000处出现预期大小的蛋白条带。单链抗体经表达、变性与复性和IMAC亲和纯化后,用于流式细胞术、免疫沉淀分析,结果表明,scFv能够与S114细胞表达Met的胞外区特异性结合,其亲和常数Kd值为4.76×10-8mol/L,与突变前抗体的亲和力(Kd值为5.24×10-6mol/L)相比,抗体的亲和力提高约100倍。竞争ELISA结果显示,亲和力成熟后抗体的抗原结合表位未变。结论经过CDR突变和抗体库筛选,有效提高了抗体的亲和力,该抗体有望成为临床肿瘤诊断或治疗的候选分子。