香烟烟雾提取物对巨噬细胞线粒体功能的影响

目的:研究香烟烟雾提取物(CSE)对巨噬细胞线粒体功能的影响。方法:本研究选取RAW264.7巨噬细胞进行实验。当细胞融合度达70%左右,弃旧培养液,将100%CSE原液用无血清的DMEM和FBS稀释成1%、5%、15%、25%和90%CSE加入到孔板中,采用CCK-8法检测不同浓度CSE处理RAW264.7细胞24 h的细胞活性;再选取最佳CSE浓度分别处理细胞0 h、24 h、48 h、72 h,CCK-8法检测CSE处理细胞不同时间组细胞活性。0%、5%和25%CSE处理24 h后,Annexin V-FITC/PI染色检测细胞坏死和凋亡情况;JC-1线粒体膜电位检测试剂盒检测细胞线粒体膜受损情况;ROS特异性染料DCFH-DA对小鼠巨噬细胞进行染色后,流式细胞计数法测定荧光度及ROS阳性巨噬细胞数目比例;增强型ATP检测试剂盒检测细胞内ATP浓度。结果:①和0%CSE组比较,1%CSE处理组细胞活性显著增加(P<0.01),当CSE浓度为5%以上时细胞活性显著下降(P<0.05);使用5%CSE处理巨噬细胞,随着处理时间的增加细胞活性显著下降(P<0.01)。②和0%CSE组比较,5%CSE和25%CSE处理主要导致巨噬细胞坏死,引起巨噬细胞线粒体膜电位显著下降、ROS生成显著增加(P<0.01)、ATP浓度显著减少(P<0.05或P<0.01),且25%CSE处理组的变化更为显著(P<0.05或P<0.01)。结论:CSE处理可能影响巨噬细胞线粒体功能,进而导致细胞活性下降并出现坏死。

老年大鼠脑组织小胶质细胞的分离及表型的流式鉴定

目的建立一种优化的方法,从老年大鼠脑组织中分离纯化小胶质细胞,并对小胶质细胞表面表型进行流式鉴定。方法以年轻大鼠(3月龄)为对照,采用IV型胶原酶联合机械消化的方式制备老年大鼠脑组织单细胞悬液,用30%-37%-70%Percoll分离液分离纯化小胶质细胞,并对细胞进行荧光标记,通过流式细胞术检测老年大鼠脑组织的小胶质细胞表型。结果采用IV型胶原酶联合机械消化,并结合密度梯度离心的方法,可以获得更多数量的单细胞,且细胞存活率均大于90%。流式检测结果显示:与年轻大鼠相比,老年大鼠脑组织M1型小胶质细胞表面标志物CD86和MHC II表达均增多(P<0.01),M2型小胶质细胞表面标志物CD200R表达也增多(P<0.01)。结论采用IV型胶原酶联合机械消化,并结合密度梯度离心分离,是较好的分离纯化成年和老年大鼠脑组织小胶质细胞的方法。