山羊痘病毒ORF037基因的克隆与原核表达

山羊痘是由山羊痘病毒引起羊的一种急性、热性、接触性传染病。山羊痘病毒推测的核心蛋白（ORF037）是其结构蛋白之一。为了研究ORF037基因的生物学特性,试验采用PCR技术扩增出NJ-2010株的ORF037基因,将其插入pET42b载体构建原核表达载体,对经酶切鉴定的阳性重组质粒进行测序和序列分析,并转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导表达蛋白质,表达产物经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析。结果表明：PCR扩增出了ORF037基因,并构建了pET42b-037原核表达载体,测序分析表明其大小为393 bp,与参考株Peller株的相似度为99.35%,NJ-2010株与山羊痘毒株在同一个分枝上,大肠杆菌中表达的蛋白质分子质量约15 ku,与预期结果大小相符。说明NJ-2010株与山羊痘毒的亲缘关系最近,且可以在大肠杆菌中表达。

流行性乙型脑炎病毒NS4B蛋白的原核表达及其结构分析

为了解流行性乙型脑炎病毒NS4B蛋白的结构及功能,本研究构建了乙脑病毒P3株ns4b基因原核表达载体,在大肠杆菌BL21中诱导表达蛋白,并通过Western blot确定所表达蛋白为目的基因的产物。DNAStar软件分析其核苷酸和氨基酸序列特征,建立遗传进化树,利用生物信息学方法对其理化性质、蛋白结构等方面进行预测。结果显示,P3株ns4b基因全长765 bp,GC含量54.64%,包含21个酶切位点,与其他毒株的遗传距离为0.8,说明ns4b基因非常保守;编码255个氨基酸,预期大小为27 KDa,其中有20个强碱性氨基酸、15个强酸性氨基酸,等电点为9.24,为碱性蛋白,中性环境中带正电。生物信息分析表明NS4B蛋白无信号肽,有3个跨膜区域;无糖基化位点,磷酸化位点26个;亲水性良好;其蛋白二级结构有较多α-螺旋与无规则卷曲,中间较大的螺旋和两端的无规则卷曲构成其特殊三级结构。试验成功构建了原核表达载体pET42b-NS4B,在大肠杆菌中以包涵体的形式表达较大量蛋白,大小与预期一致。JEV-ns4b是该病毒较为关键的非结构蛋白基因,可通过原核表达系统高效表达蛋白,研究其蛋白功能,有助于进一步优化乙型脑炎疫苗。

山羊痘病毒069蛋白的表达与结构分析

为了分析山羊痘病毒THx株069基因的分子特征及其编码蛋白的生物学功能,本试验应用PCR技术对069基因进行扩增,并构建原核表达载体,经测序鉴定后用IPTG诱导表达其蛋白,应用SDS-PAGE和Western blot进行蛋白鉴定。用DNAStar及Mega软件对GenBank登录的24个该基因参考序列进行同源性比对并作遗传进化树分析;同时采用生物信息学分析方法对069蛋白信号肽、跨膜结构、糖基化位点、磷酸化位点、抗原决定簇、亲水性、二级及三级空间结构进行预测。结果表明:GTPV-069号基因全长为573 bp,与参考株GTPV-pellor相似度高达97.19%,经同源性比对与遗传进化树分析发现,山羊痘病毒THx株069基因序列与绵羊痘亲缘关系较近,在同一分支上,与疙瘩皮肤病和其他山羊痘亲缘关系较远。SDS-PAGE鉴定表明069蛋白大量表达于上清中,条带清晰。Western blot结果证明069蛋白与His标签确实进行了融合表达;生物信息学分析发现GTPV-069蛋白无信号肽、含有跨膜结构,跨膜区在29~51 aa之间,为典型的膜蛋白。069蛋白含有8个抗原决定簇、1个糖基化位点和14个磷酸化位点。二级结构分析显示,069蛋白中α螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-转角分别占43.46%,25.65%,23.04%和7.85%,三级结构预测发现069蛋白以α螺旋为主。本试验为后期探究羊痘病毒其他部分生物学功能以及新型羊痘疫苗的研制提供了依据。