反义VEGF_(165)真核表达载体的构建和表达

目的 进行抗血管生成治疗人脑胶质瘤实验 ,构建和鉴定携带人反义 VEGF1 6 5 基因的真核表达载体 .方法 将VEGF1 6 5 c DNA反向克隆入 pc DNA3,构建 CMV启动子控制的真核表达载体 pc DNA- AVEGF1 6 5 ,用酶切鉴定结果 ;应用该载体转染人脑胶质瘤细胞 SHG44 ,G418筛选阳性克隆 ;Western blot和免疫组化检测转染前、后瘤细胞的 VEGF表达 .检测转染前、后瘤细胞的生物学性状 .结果 获得反向构建的 pc DNA- AVEGF1 6 5 真核表达载体 ,VEGF1 6 5 反义 RNA阻断了 SHG44细胞的 VEGF表达 ,该细胞生物学性状不受外源基因的表达影响 .结论 成功构建的反义 VEGF1 6 5 真核表达载体 。

外源性血管抑素K(1-3)基因在人脑胶质瘤中的表达意义

目的 探讨外源性血管抑素 K(1- 3)基因[angiostatin K(1- 3) ,AK(1- 3) ]在人脑胶质瘤中的表达及其作用 .方法 应用 PCR法 ,使人 Ig kappa链分泌信号肽序列S加装在 AK(1- 3)基因上 - SAK(1- 3) ;构建 SAK(1- 3)基因的真核表达载体 pc DNA- SAK(1- 3) .经脂质体法将其转染入SHG44人脑胶质瘤细胞 ,行 G418筛选获得转基因瘤细胞克隆 ,比较转基因和未转基因的瘤细胞生物学特性 .以免疫荧光、免疫组化和内皮细胞抑制实验检测瘤细胞表达的 AK(1-3)蛋白及其活性 .应用裸鼠皮下致瘤性实验 ,结合 SHG44瘤组织的各项检测 ,确定肿瘤表达 AK(1- 3)蛋白对人脑胶质瘤生长的影响 .结果 外源性 AK(1- 3)的表达不影响 SHG44瘤细胞的生物学特性 ,它能在体外抑制内皮细胞生长 ;表达AK(1- 3)的胶质瘤细胞体内致瘤性显著下降 ,抑瘤率为 76 .8% .结论 肿瘤表达的 AK(1- 3)蛋白能抑制其自身生长 ,该机制是通过抑制胶质瘤的血管生成 。

Angiostatin K(1-3)基因的原核表达和蛋白活性测定

目的 获得angiostatinK(1 3)基因的原核表达蛋白 ,检测其活性。方法 构建和鉴定pBV2 2 0 AK(1 3)载体并在大肠杆菌DH5α内表达 ,诱导后用SDS PAGE分析、经亲和层析纯化后行WesternBlot鉴定 ,以牛微血管内皮细胞抑制实验和鸡胚绒毛膜尿囊膜实验验证其生物学活性。结果 获得抑制牛微血管内皮细胞生长活性的angiostatinK(1 3)原核表达蛋白 ,其蛋白重量占菌体总蛋白的 7%。

局部分泌的血管抑素K(1～3)蛋白抑制人脑胶质瘤生长的实验研究

目的 探讨局部分泌血管抑素K(1～ 3)蛋白 [angiostatinK (1～ 3) ,AK(1～ 3) ]治疗人脑胶质瘤的可行性。方法 构建AK(1～ 3)基因的真核表达载体pcDNA -SAK(1～ 3) ,经脂质体法将该载体转染入人脑胶质瘤细胞SHG44 ,行G418筛选。用电镜和流式细胞仪测定转染细胞的生物学性状 ,以内皮细胞抑制实验和免疫荧光实验检测该细胞表达的AK(1～ 3)蛋白。应用裸鼠皮下致瘤性实验 ,结合免疫组织化学、电镜、微血管和瘤体坏死区计数 ,确定局部分泌AK(1～ 3)蛋白对裸鼠皮下人脑胶质瘤生长的影响。结果 成功构建pcDNA SAK(1～ 3)载体并在人脑胶质瘤细胞获得表达 ,该细胞在裸鼠皮下致瘤性和诱导血管生成能力显著下降 (肿瘤终体积实验组为 170mm3,对照组为 812 0mm3,P <0 .0 1;血管计数 ,实验组为 5 .4,对照组为 12 .2 ,P <0 .0 1)。结论 局部分泌的AK(1～ 3)蛋白能抑制裸鼠皮下人脑胶质瘤血管生成和肿瘤生长 ,可进一步用于实体瘤的治疗研究。