门静脉血循环肿瘤细胞、C反应蛋白/清蛋白、糖类抗原199/糖类抗原50比值联合评估根治性胰腺癌切除术后生存情况的研究

目的:研究门静脉血循环肿瘤细胞(CTCs)、C反应蛋白/清蛋白(CAR)、糖类抗原199/糖类抗原50(CA199/CA50)比值联合评估根治性胰腺癌切除术后患者的生存情况。方法:选取我院2018年1月—2020年1月收治的83例接受胰腺癌根治术患者。检测患者门静脉血的CTCs、CAR、CA199/CA50水平,比较不同病理特征患者的CTCs、CAR、CA199/CA50水平。对患者随访2年,分析生存与死亡患者门静脉血CTCs、CAR、CA199/CA50水平,采用受试者工作特征曲线分析CTCs、CAR、CA199/CA50对患者术后生存的评估价值,并用Kaplan-Meier生存曲线分析CTCs、CAR、CA199CA50对肝癌患者的影响。结果:存在淋巴结转移、TNM分期Ⅲ期和低分化程度患者的门静脉血CTCs、CAR、CA199/CA50水平均高于不存在淋巴结转移、TNM分期为Ⅰ-Ⅱ期和中高分化程度的患者(P<0.05)。与死亡组患者相比,生存组患者门静脉血CTCs、CAR、CA199/CA50水平更低(P<0.05)。门静脉血CTCs、CAR、CA199/CA50对于根治性胰腺癌切除术患者预后评估的灵敏度分别为78.9%、78.8%和73.7%,特异度分别为90.6%、91.0%和91.2%,三者联合对根治性胰腺癌切除术患者预后评估的灵敏度为89.5%,特异度为93.7%,三者联合对于根治性胰腺癌切除术患者预后的灵敏度和特异度均高于各项单独检测。CTCs正常组(n=50)的生存率为86.00%,高于CTCs升高组(n=33)的63.63%;CAR正常组(n=47)的生存率为82.97%,高于CAR升高组(n=36)的69.44%;CA199/CA50正常组(n=53)的生存率为88.67%,高于CA199/CA50升高组(n=30)的56.66%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:门静脉血CTCs、CAR、CA199CA50比值联合评估根治性胰腺癌切除术后的生存价值较高,三者联合的灵敏度和特异性高于各项单独检测。

小鼠胰岛分离纯化后肾被膜下胰岛移植动物模型的建立

目的：探讨一种分离纯化小鼠胰岛细胞的优良新型方法,经同种异体糖尿病小鼠肾被膜下胰岛移植建立动物模型.方法：（1）胰岛分离及检测：采用胆总管内胶原酶逆行灌注消化胰腺的方法分离胰岛,淋巴细胞分离液单一密度梯度离心法纯化胰岛.利用双硫腙对胰岛进行特异性染色来计算胰岛产量及纯度,台盼兰染色鉴定胰岛细胞的活性,以葡萄糖刺激胰岛素释放来检测胰岛功能.（2）胰岛移植：空白对照组（n =12）,糖尿病鼠组（n=12）,对糖尿病鼠组行同种异体鼠肾被膜下胰岛移植,观测血糖及生命体征变化.结果：每只小鼠可获得150～200个高质量胰岛,纯度及活性均高于90 ％,葡萄糖刺激后胰岛素释放量明显增加（SI=3）.糖尿病小鼠经胰岛移植后,1～3 d内,血糖均降至11.1 mmol/L以下.结论：采用新改进的分离纯化胰岛方法,可获得高质量、高功能的胰岛细胞.经同种异体糖尿病小鼠肾被膜下胰岛移植动物模型的成功建立,为进行人胰岛小鼠移植及人胰岛同种异体移植提供重要试验价值.

糖尿病小鼠左肾被膜下胰岛细胞与胰腺外分泌细胞共同移植动物模型的建立

目的：建立糖尿病小鼠左肾被膜下同种异体胰岛细胞与胰腺外分泌细胞共同移植动物模型及探讨胰腺外分泌细胞对胰岛移植物的损伤作用.方法：（1）体内实验：采用胆总管内逆行灌注胶原酶联合淋巴细胞分离液的方法来分离纯化胰岛,人工挑取胰岛细胞并收集胰腺外分泌细胞.链脲佐菌素腹腔注射诱导BALB/C小鼠成为糖尿病小鼠.单纯移植组（n=10）每只小鼠于左肾被膜上极移植胰岛细胞250个,共同移植组（n =10）每只小鼠于左肾被膜上下极同时移植胰岛细胞250个和等体积的胰腺外分泌细胞,持续观测血糖及生命体征变化,1个月后切除左肾并继续检测血糖.（2）体外实验：利用双硫腙对胰岛进行特异性染色来计算胰岛产量及纯度,利用台盼蓝染色鉴定胰岛细胞的活性,以及用葡萄糖刺激胰岛素释放实验来检测胰岛功能.结果：（1）胰岛移植后,单纯移植组及共同移植组血糖均逐步降至正常,共同移植组较单纯移植组血糖恢复正常时间延迟,移植术后第2,3,4,5天,单纯移植组受鼠血糖低于共同移植组,差异有统计学意义（P＜0.05）.切除两组受鼠左肾3d后,两组受鼠血糖均＞21 mmol/L.（2）每只小鼠可获得150～200个高质量胰岛,纯度及活性均高于90％,葡萄糖刺激后胰岛素释放量明显增加（SI=2.90）.结论：（1）成功建立糖尿病小鼠左肾被膜下同种异体胰岛细胞与胰腺外分泌细胞共同移植动物模型.（2）胰腺外分泌细胞与胰岛细胞同时移植会延迟植入胰岛功能恢复正常的时间.

生长抑素减轻小鼠胰岛移植过程中胰腺外分泌细胞对移植胰岛的损伤

目的 观察与探讨生长抑素减轻小鼠胰岛移植过程中胰腺外分泌细胞对移植胰岛的损伤及其机制.方法 （1）体外实验：选取20只雄性BALB/C小鼠,采用随机数字表法分为生长抑素组和生理盐水组,每组10只.在获取胰岛手术麻醉前30 min,生长抑素组小鼠腹腔注射生长抑素10μg/g,生理盐水组注射等体积的生理盐水,然后分别收集两组小鼠的胰腺外分泌细胞及胰岛细胞,流式细胞仪检测两种细胞凋亡情况.（2）体内实验：获取小鼠胰岛及胰腺外分泌细胞,并对胰岛进行纯度及活性检测.应用链脲佐菌素建立小鼠糖尿病模型,然后进行胰岛移植,分别于小鼠左肾被膜上、下级同时移植胰岛250个及等体积的胰腺外分泌细胞.采用随机数字表法将成功建立胰岛移植模型的40只小鼠平均分为2组,实验组术后腹腔注射生长抑素,连续28 d,对照组术后注射等体积生理盐水,连续28 d.同时两组小鼠分别腹腔注射5乙炔基-2＆#39;-脱氧尿苷（EDU）5 μg/g,连续28 d.术后连续监测小鼠血糖;术后第8天,两组小鼠均进行葡萄糖耐量实验（IPGTT）;术后10和28 d两组各随机选取10只小鼠分别切除左肾,采用免疫组织化学法检测左肾包膜下抗淀粉酶抗体的表达,采用免疫荧光染色法检测移植胰岛β细胞增殖情况.结果 （1）流式细胞检测结果显示,生长抑素组小鼠胰腺外分泌细胞凋亡率明显高于对照组（P＜0.05）,两组间胰岛细胞凋亡率的差异无统计学意义（P＞0.05）;（2）获取的小鼠胰岛纯度及活性均高于95％.胰岛移植后,两组小鼠血糖均恢复正常,对照组较实验组血糖恢复正常时间延迟（P＜0.05）,对照组的血糖水平明显高于实验组;IPGTT实验结果显示移植物血糖调节功能正常;术后10d实验组和对照组移植物周围均可见抗淀粉酶抗体阳性颗粒,但实验组阳性颗粒数较对照组减少（P＜0.05）;免疫荧光检测显示,实验组移植胰岛Insulin＋ EDU＋β细胞数较对照组明显增多（P＜0.05）.术后28 d,实验组抗淀粉酶抗体阳性颗粒数较对照组明显减少（P＜0.05）,但与术后10d相比两组均无明显变化（P＞0.05）,实验组增值的β细胞数仍明显高于对照组（P＜0.05）,但与术后10天相比两组增殖率均显著降低（P＜0.05）.结论 生长抑素可以减轻小鼠胰岛移植过程中胰腺外分泌细胞对移植胰岛的损伤,这可能与生长抑素诱导小鼠胰腺外分泌细胞的凋亡,抑制胰腺外分泌细胞胰淀粉酶的分泌,以及促进胰岛β细胞增殖等因素有关.

α-1抗胰蛋白酶减轻小鼠胰腺外分泌细胞对移植胰岛的损伤

目的探讨α-1抗胰蛋白酶（A1AT）减轻胰腺外分泌细胞对移植胰岛的损伤及促进胰岛口细胞增殖。方法（1）体外实验：选10只BALB／c小鼠，挑取所有的胰岛并收集胰腺外分泌细胞。纯化胰岛组（n=6），每孔100个胰岛，常规培养；实验组（n=6），每孔100个胰岛和等体积外分泌细胞同时培养，并加入A1AT（0．5mg／m1）；对照组（n=6），每孔100个胰岛和等体积外分泌细胞同时培养。48h后，收集各孔上清液，分别检测胰岛素含量及胰蛋白酶浓度；然后分别换低糖、高糖RPMI-1640培养液，行胰岛素释放实验。（2）体内实验：链脲佐菌素腹腔注射诱导BALB／c小鼠成为糖尿病小鼠。实验组（n=10）和对照组（n=10）分别于小鼠左肾被膜上下级同时移植胰岛细胞250个和等体积的胰腺外分泌细胞，术后实验组按腹腔注射A1AT83mg／kg（28d），对照组注射等量生理盐水（28d），同时两组小鼠分别按0．5btg／g腹腔注射EDU（28d）。1个月后切除左肾，免疫组织化学染色法检测左肾包膜下抗淀粉酶抗体的表达，免疫荧光染色法检测移植胰岛B细胞增殖情况，并继续检测血糖。结果（1）纯化胰岛组胰岛素含量为（1．53±0．33）μg／孔，实验组为（1．26±0．13）μg／孔，对照组为（0．82±0．24）μg／孔，各组间的差异均有统计学意义（P〈0．01）。纯化胰岛组胰蛋白酶浓度为（1．05±0．22）ng／ml，实验组为（2．42±0．44）ng／ml，对照组为（5．73±1．12）ng／ml，各组间的差异均有统计学意义（P〈0．01）。纯化胰岛组胰岛素刺激指数为4．11±1．45，实验组为2．53±1．52，对照组为1．32±1．12，各组间的差异均有统计学意义（P〈0．01）。（2）胰岛移植后，实验组和对照组血糖均降至正常，对照组较实验组血糖恢复正常时间延迟，组间差异有统计学意义（P〈0．05）。切除两组小鼠左肾3dN，两组小鼠随机血糖均〉21mmol／L。对照组移植物周围可见大量抗淀粉酶抗体阳性颗粒，实验组较对照组明显减少。免疫荧光检测显示实验组移植胰岛Insulin’／EDU’8细胞数较对照组明显增多。结论（1）胰岛细胞与胰腺外分泌细胞在体外共同培养时加入A1AT可以缓解胰腺腺泡细胞分泌的蛋白酶对胰岛的破坏。（2）胰岛细胞与胰腺外分泌细胞共同移植在糖尿病小鼠体内，腹腔注射AIAT可以明显减少腺泡细胞胰蛋白酶的分泌，减轻胰腺外分泌细胞对移植胰岛的损伤，促进胰岛B细胞的增殖。