A20基因在活性氧对内皮细胞损伤中的保护作用

目的:探讨外源性锌指蛋白A20对氧损伤诱导内皮细胞同型半胱氨酸蛋白酶Caspase3表达和凋亡的影响。方法:DOTAP脂质体介导pcDNA3.1EHA20质粒转染人脐静脉内皮细胞,经G418筛选,免疫荧光检测A20基因的表达,Tunnel原位末端标记法、原位杂交检测转染前后过氧化氢诱导内皮细胞凋亡情况及Caspase3的表达情况。结果:A20基因在内皮细胞得到有效表达,正常对照组及转染A20基因组人内皮细胞凋亡为(4±1)%,过氧化氢作用后对照组与转染A20基因组凋亡分别为(21±2)%,(6±1)%,两者相差有显著性意义(P<0.05)。A20基因能显著抑制过氧化氢诱导的内皮细胞Caspase3的表达。结论:A20基因在活性氧对内皮细胞损伤中具有保护作用,在缺血再灌注等相关疾病防治方面可能有一定作用。

转染锌指蛋白基因A20抑制内毒素诱导的内皮细胞IL-8表达的研究

目的 探讨转染外源性锌指蛋白基因A2 0对内毒素诱导的内皮细胞白细胞介素 8(IL 8)表达的影响。方法 DOTAP脂质体介导pcDNA3 .1EHA2 0质粒转染人脐静脉内皮细胞 ,经G418筛选 ,免疫荧光检测A2 0基因的表达 ,双抗夹心ELISA法检测内皮细胞分泌IL 8的含量变化。结果 A2 0基因在经G418筛选后的内皮细胞中得到高效表达 ;内毒素能刺激人内皮细胞分泌IL 8;A2 0基因能减少 70 %以上内毒素诱导的内皮细胞IL 8的分泌 ,两者间相差显著 (P <0 0 5 )。结论 转染外源性A2 0基因能够显著抑制内毒素诱导的内皮细胞活化 ,有助于炎症的治疗。

锌指蛋白基因对内毒素诱导选择素表达的影响

目的 探讨外源性A2 0基因对内毒素诱导的内皮细胞E 选择素表达的影响。 方法 DOTAP脂质体介导的pCNDA3 1EHA2 0基因转染人脐静脉内皮细胞 ,经G4 18筛选阳性克隆 ,免疫荧光检测A2 0基因的表达 ,原位杂交、免疫荧光及Westernblot分别检测内皮细胞E 选择素的表达。 结果 A2 0基因在经G4 18筛选后的内皮细胞中有高表达 ;内毒素能诱导人内皮细胞E 选择素表达 ;A2 0基因能抑制内毒素诱导的内皮细胞 90 %的E 选择素表达 ,两者间相差显著 (P <0 0 5 )。 结论 A2 0基因能够显著抑制内毒素诱导的内皮细胞活化 ,有助于创伤的治疗。

锌指蛋白基因抑制氧损伤诱导的内皮细胞E-选择素的表达

目的 :探讨外源性锌指蛋白基因A2 0对氧损伤诱导的内皮细胞E 选择素表达的影响。方法 :DOTAP脂质体介导 pcDNA3 .1EHA2 0质粒转染人脐静脉内皮细胞 ,经G41 8筛选 ,免疫荧光检测A2 0基因的表达 ,原位杂交、免疫组化分别检测过氧化氢诱导的内皮细胞E 选择素表达。结果 :A2 0基因在经G41 8筛选后的内皮细胞中得到高效表达 ,过氧化氢能诱导人内皮细胞E 选择素高表达 ,而A2 0基因能抑制 80 %以上过氧化氢诱导的内皮细胞E 选择素表达 ,两者间相差显著。结论 :A2 0基因能够显著抑制过氧化氢诱导的内皮细胞活化 ,有助于氧损伤的治疗。

血管石蜡切片起皱原因的探讨

采用常规石蜡包埋H.E染色法制作空腔器官特别是血管组织切片,有时会出现皱褶,甚至结构不完整。凌启波等认为阑尾组织因其密度的不同,若采用高浓度乙醇起始脱水,将导致切片出现皱褶。作者在常规制作人、狗、兔、大鼠股动脉石蜡切片中,发现兔和大鼠的动脉不出现皱褶,而人和狗的切片却易出现皱褶,尤以狗动脉外膜更易出现放射状皱褶。不同种属动物的动脉组织切片出现和不出现皱褶的原因尚未得到解释,为此作者进行了实验探讨。

固定剂对动脉管壁弹性蛋白染色的影响

血管壁的形态和弹性问题与临床联系较密切,而管壁中弹性蛋白(弹性纤维)的相对含量、立体构筑及代谢状况对维持血管尤其是动脉的正常结构及弹性回缩功能起着重要作用。在用图像分析技术对动脉管壁弹性蛋白进行定量分析时,为避免其它成份混染造成的测量误差,常采用特殊染色法单独显示弹性蛋白。

NADPH-d组化方法染色条件的探讨

运用定量分析方法对NADPH－d组化染色方法进行了初步探讨。实验对象采用在鼠海马，固定后的标本冰冻冠状连续切片35urn，切片染色封装后，光镜下图像分析方法定量观测染色效果。结果显示以下几个因素对染色的影响颇大。1．染液的配方：我们推荐NBT浓度为0.1mg／ml，NADPH－d浓度为1mg／ml，0．IMPBSpH7．3，Triton－100浓度为03％的配方。提高NBT浓度至0．2、04、0sing／ml，染色速度加快，但易造成深染细胞的过染而使神经元形态不清并易造成切片污染。NADPH—d的浓度最小值是ling／ml，较低的浓度05～08mg／ml染色速度减慢且着色浅淡，染色细胞数量减少。较高的浓度1．2、1．sing／ml与ling／ml的染色效果类似，但染色时间缩短。2．固定液：4％多聚甲醛固定的标本中，NADPH－d染色阳性神经元见于海马除锥体细胞层的其它各层，染色细胞为原生型NOS神经元，4％多聚甲醛＋1．25％戊H醛固定的标本可使锥体细胞显示淡阳性，似可以使内皮型NOS神经元（eNOS）显示阳性。因此，选用不同固定液有助于确定NOS的类型。3．染色时间：37C下温育以40～60分钟为宜，时间过长可造成某些胶质细胞的染色并可使染色过深。通过试验我们认为：对脑组织进行NADPH－d染色的适宜条件为：NBT浓度：0．l一0．12ms／ml。

核心结合因子α1对骨髓间充质干细胞成骨细胞标志基因表达的影响

目的探讨核心结合因子α1(core-binding factor α1,Cbfa1)对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨定向分化的作用. 方法抽取3月龄日本大白兔股骨骨髓,密度梯度离心获得MSCs,以Cbfa1重组腺病毒转染第3代MSCs,3 d后免疫荧光法观察目的基因的表达,并于1～7 d MTT法检测其对细胞增殖的影响(Cbfa1腺病毒处理组).以正常培养组、单纯诱导组和对照腺病毒处理组作为对照,各组设置7、14 d两个时间点进行观察.RT-PCR法半定量分析Cbfa1腺病毒处理对MSCs碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨钙素(osteocalcin,OC)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和I型胶原等多种成骨细胞标志基因的影响,同时观察Cbfa1对MSCs成脂、成肌分化指标过氧化物酶体增殖物激活受体γ2和生肌决定因子的影响. 结果①免疫荧光显示,转染Cbfa1重组腺病毒后MSCs可以表达Cbfa1;②各组MSCs增殖差异无统计学意义(P>0.05);③RT-PCR显示7、14 d,Cbfa1腺病毒处理组ALP、OC和OPN的表达均明显上调,Ⅰ型胶原的表达基本不变;④Cofa1使PPARγ、MyoD的表达受到抑制. 结论 Cbfa1能明显促进MSCs成骨方向的分化.

肝圆韧带的断面解剖及其显微结构成份分析

笔者观察了２４例成人肝圆韧带的断面解剖，应用ＭＡＳ－１图像分析系统测量了一些力学参数。结果表明：成人的肝圆韧带存在残腔，为一潜在性开放性结构。残腔壁覆盖有单层扁平内皮细胞。肝圆韧带管壁保留了血管的结构特征，依然可分为内膜、中膜、外膜三层。肝圆韧带由腱膜下段向游离段及裂隙段过渡中，外径逐渐增粗，管壁厚度及残腔逐渐增大。肝圆韧带的组成，以胶原纤维为主，弹性纤维及平滑肌次之。在肝圆韧带由腱膜下段、游离段向裂隙段及脐门连接处过渡中，弹性纤维的相对含量有所减少，平滑肌的相对含量略有增加。其胶原纤维与弹性纤维相对含量比值（Ｃ／Ｅ比值）之比为：１：１．１１：１．２１：１．２１。结果提示从肝圆韧带至脐门连接处，相对刚度逐渐扩大，可扩张性逐渐减少。肝圆韧带可施行人工再道。

成人尸体阴茎延长长度的测量及其静脉淋巴管的解剖学观察

目的 为阴茎延长术、阴茎断后再植、阴茎包皮环切、血管性阳痿等术后水肿及其治疗提供解剖学依据,并为阴茎延长手术疗效提供实验室数据。方法 在16例正常成人新鲜尸体标本上按照阴茎延长术手术方法切断阴茎浅悬韧带后测量阴茎延长的长度,并将此长度与身高进行统计学比较。另选40例新鲜阴茎标本行静脉血管铸型及淋巴管间接注射Shiff染色并结合解剖方法,观察其数量、走行、分布特点。结果 切断阴茎浅悬韧带后阴茎延长长度在2～3cm范围,与身高无明显相关。注入龟头及包皮系带的10 %印度墨汁主要通过阴茎背侧及双侧形成的2～4条阴茎浅组淋巴管主干回流,此主干与背浅静脉伴行,腹侧未见淋巴管显色。结论 在静止状态下,阴茎延长术后,阴茎的延长范围为2～3cm ;海绵体注射时尽量选择阴茎侧面近1/ 3血管稀疏区。阴茎延长术后皮下顽固水肿与背浅静脉、背侧及双侧淋巴管损伤有密切关系。

肝圆韧带修复胆道缺损的形态学基础

解剖观测５７例成人尸体标本，结果表明：肝圆韧带自脐切迹延伸至门静脉左于囊部，可分为腱膜下段、游离段和裂隙段三段，各段长度分别为６．２±２．２．７．１±１．８，３．９±０．７ｃｍ。在成人，肝回韧带为一开放性结构，各段均可见残腔，游离段和裂隙段内残腔常呈连续性腔隙，长度达８．９±２．１ｃｍ。肝圆韧带管壁可分为内膜、中膜、外膜三层，主要由纤维结缔组织构成。肝圆韧带由腱膜下段向游离段和裂隙段过渡过程中，外径逐渐增粗，管壁厚度及残腔管径逐渐增大。肝圆韧带紧邻胆道，易于游离和取材，是修复胆道缺损较好的自体生物材料，且以游离段为适宜。肝圆韧带修复胆道缺损已在临床应用１２例，取得满意疗效。

生物血管基质材料的抗原表达及力学特性

了解胰蛋白酶处理前后版纳微型猪近交系血管的抗原表达及力学特性 ,为异种移植及猪血管用于血管组织工程基质材料提供资料。取猪颈动脉 ,胰蛋白酶预处理猪血管前后不同时相点取标本石蜡包埋 ,采用组织形态学方法结合计算机图像分析 ,对猪血管几何形态及纤维结构进行形态定量学研究 ,分别测定胰蛋白酶作用前后猪动脉压力直径关系。冰冻切片 ,用亲和免疫组化法检测 α- gal抗原表达。结果表明 α- gal抗原仅表达于血管内皮细胞 ,胰蛋白酶预处理血管后 ,未见 α- gal抗原表达 ,血管内细胞包括内皮细胞、平滑肌细胞已去除 ,HE染色未见纤维断裂 ,血管无明显形变 ,处理前后血管顺应性相差不显著。提示经胰蛋白酶预处理的猪血管抗原性大大降低 ,其力学特性相差不显著 。

TGFβ_1基因对血管内皮细胞细胞外基质表达及与基质黏附的影响

了解TGFβ1基因对血管内皮细胞表达细胞外基质蛋白及与基质黏附力的影响。用DOTAP脂质体转染p MAMneo TGFβ1于原代培养的脐静脉内皮细胞,经G4 18筛选,TGFβ1表达经免疫荧光鉴定。Western blot确定 型胶原、纤黏连蛋白的表达,微管吸吮系统确定内皮细胞与基质的黏附力。结果表明生理情况下的内皮细胞能表达少量的TGFβ1及胶原、纤黏连蛋白。经G4 18筛选,外源性TGFβ1在血管内皮细胞中稳定表达,能显著提高胶原、纤黏连蛋白纤维的表达及细胞与基质的黏附。说明TGFβ1在血管组织工程中促进内皮细胞的黏附具有一定的应用价值。

Wnt/β-catenin对低氧诱导绿色荧光蛋白小鼠神经干细胞体外增殖的影响

目的:体外观察低氧对绿色荧光蛋白(GFP)小鼠神经干细胞(NSCs)增殖的影响,并探讨Wnt/β-catenin通路在此过程中的作用。方法:经低氧(3±2)%O_2和常氧205O_2培养GFP小鼠海马组织NSCs,通过NSCs克隆形成率检测、BrdU掺入法和四唑盐比色法(MTT)法检测细胞增殖情况;脂质体介导法将NSCs转染β-catenin,通过免疫细胞化学染色、Western印迹法检测β-catenin表达情况,MTT法检测转染β-catenin后低氧对NSCs增殖的影响。结果:低氧组细胞克隆球形成率、BrdU阳性细胞数量、NSCs增殖活性、NSCs内β-catenin表达均显著高于常氧组;转染β- catenin的NSCs经低氧培养后,NSCs增殖活性明显高于未转染组。结论:体外低氧培养能促进NSCs增殖和NSCs内β-catenin表达;增加NSCs中β-catenin表达能促进低氧培养下NSCs的增殖。表明Wnt/β-catenin通路具有促进低氧诱导NSCs增殖的作用。

动脉吻接后的顺应性变化

本实验通过在体测定狗股动脉端端吻合前及吻合后不同时相点的压力与直径相应数据，推导出动脉吻接前后的顺应性，找出顺应性与平均血压的关系。结果表明：动脉吻接后吻合口段的顺应性较吻接前逐日下降，吻合后１４天下降最明显，以后有所回升。反映了动脉吻合后其吻合口段的可扩张能力减弱。吻合后动脉的顺应性随血管修复过程呈现动态变化。

版纳微型猪近交系肾脏的应用解剖研究

目的 了解版纳微型猪近交系肾脏的解剖结构 ,为异种肾移植提供基础资料。 方法 版纳微型猪近交系 2 0头处死后 ,解剖显微镜及游标卡尺检测新鲜及灌注固定的原位和离体肾脏、肾血管及输尿管 ,将肾脏组织标本石蜡包埋行 HE染色。 结果 猪肾脏组织、出入的肾血管及输尿管类似人的相应结构 ,猪肾脏皮质厚度为 (2 0 .0±2 .4) mm,肾动脉平均直径与人髂内动脉直径平均值 5.1 mm相接近 ,所有被测肾均为单支动脉。肾被膜与人肾相似 ,均为纤维层、脂肪层及肾筋膜。左右输尿管直径分别为 5.1 mm和 4.7mm。

生物血管主要组织相容性复合体抗原表达及内皮化的实验研究

为了解胰蛋白酶处理前后版纳微型猪近交系血管的主要组织相容性复合体 (Major histocom patibilitycomplex,MHC)表达及去细胞后重新内皮化情况 ,为异种移植及猪血管用于血管组织工程提供资料 ,取猪颈动脉 ,胰蛋白酶预处理猪血管前后 Western Blot法检测 MHC抗原表达 ,在自行设计制作的新型动力性生物反应器中 ,用原代培养的内皮细胞种植在去细胞血管基质材料表面 ,扫描电镜检测内皮化效果。结果表明 ,胰蛋白酶预处理血管后 ,未见 MHC抗原表达 ,扫描电镜可见血管腔内皮细胞形态正常 ,沿血管长轴分布 ,提示经胰蛋白酶预处理的猪血管 MHC抗原大大降低 ,人内皮细胞能成功内皮化 。

小鼠 noggin 基因的重组腺病毒构建与鉴定

目的：构建小鼠 noggin 基因的重组腺病毒载体并鉴定。方法：采用基因工程技术。经过2次亚克隆将 noggin 基因片段克隆至穿梭质粒 AdTrack-CMV 上,利用 pAdEasy-1系统进行细菌内同源重组后,脂质体转染 293T 细胞包装、扩增。采用 PCR 方法对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白 GFP 报告基因,对病毒滴度和感染效率进行监测。结果：酶切鉴定及 PCR 结果证明 noggin 基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达6．3×10^(10)pfu/ml。结论：应用细菌内同源重组法成功构建了含小鼠 noggin 基因的重组腺病毒载体。