人肠道病毒71型感染免疫抑制恒河猴的分析

目的:通过建立人肠道病毒71型(EV71)感染在免疫抑制恒河猴的动物模型,进一步分析人EV71在免疫抑制动物体内病毒增殖、病理变化以及病毒抗原在不同组织的表达情况。方法:按照每天15 mg/kg的剂量给8只恒河猴口服环孢菌素A连续7 d后造成其免疫抑制状态,再经呼吸道和消化道感染EV71病毒FY23株,对其进行14 d的临床观察后处死,采集各器官组织进行病毒载量检测,同时对不同的组织进行病理学分析和免疫组化分析。结果:感染EV71病毒后,免疫抑制组的临床症状、病毒载量、病理分析和免疫组化结果都明显比非免疫抑制组严重,从病毒对机体造成的影响来看呼吸系统感染较消化系统感染明显严重。结论:本实验分析了人EV71在免疫抑制动物体内病毒增殖的情况,为建立用于EV71疫苗评价的恒河猴动物模型提供了依据,并对未来的EV71疫苗的使用人群范围做出了新的限定。

肠道病毒71型灭活疫苗免疫恒河猴在攻毒实验中的感染动力学

本文旨在根据前期研究建立的恒河猴感染动物模型,对同期研制的肠道病毒71型(EV71)实验性灭活疫苗免疫动物进行全面的免疫保护性评价。评价指标包括病毒攻击后动物体内病毒载量及病理学变化,根据所得结果进行实验性疫苗免疫后动物在病毒攻击中的感染动力学分析。3个疫苗剂量(20、80、320EU)免疫的恒河猴均出现不同效价的中和抗体,80EU和320EU剂量组在二次免疫后第6周抗体效价达1∶128～1∶256,经104.5CCID50病毒鼻腔攻击后均未检出阳性病毒载量。20EU剂量组中,淋巴器官、中枢神经系统及其他主要脏器均出现比对照组低但仍为阳性的病毒增殖现象。病理学方面,各剂量组免疫恒河猴的中枢神经系统以及肺等器官均未出现相关病理损伤。本实验在确定该疫苗对恒河猴有效保护性的同时,亦为明确EV71灭活疫苗免疫剂量提供了直接的实验依据。

丙型肝炎病毒多表位抗原的原核表达及免疫原性分析

目的:研究丙型肝炎病毒(HCV)十表位抗原HCVe在大肠杆菌中的非融合表达及其免疫原性分析。方法:在大肠杆菌DH5α中表达非融合蛋白HCVe,纯化该蛋白后利用Westerb blot分析其抗原反应性。免疫小鼠,检测其免疫特异性。结果:HCVe十表位抗原能在原核表达系统中高效表达。Western blot和ELISA分析表明HCVe十表位抗原能与HCV病人阳性血清特异性结合,并可诱发小鼠产生特异性HCV抗体。结论:表达的HCVe十表位抗原具有特异的抗原反应性及免疫原性。

利用恒河婴猴模型对肠道病毒71型传播感染特征的生物学分析

本文在前期工作基础上,进一步对肠道病毒71型（EV71）从恒河婴猴的感染个体向其他未感染个体传播的可能性及相关生物学特性做了初步分析。通过喷雾形式经呼吸道感染1~2月龄恒河婴猴（A组）;在观察临床症状同时,于感染后第7天,取该组动物粪便处理后,将上清液以喷雾形式经呼吸道感染新的婴猴个体（B组）,随后对该次代感染个体进行同样临床观察;并对哺乳B组婴猴的母猴（C组）也进行全面观察和分析。同时,将A组动物粪便处理后的上清液经血液感染的婴猴作为对照。分析临床症状,血液、粪便及咽拭子病毒载量,中和抗体效价,组织病理学改变。结果提示,恒河婴猴作为EV71感染动物模型,能反映病毒在个体间传播的基本生物学特征。依据实验结果,可以初步推断,EV71在易感人群中的主要传播途径是呼吸道;同时,病毒也可从低龄个体向成年个体传播。这些资料为进一步探讨EV71在儿童群体中的发病规律提供了一定的理论依据。

肠道病毒71型灭活疫苗在婴猴保护性实验中的病理性炎症反应

目的 分析肠道病毒71型（EV71）灭活疫苗（人二倍体细胞）对动物的免疫是否能够导致由抗病毒免疫反应所引起的免疫病理损伤,以确定该实验性疫苗的安全性.方法 利用恒河猴婴猴作为实验动物,未经免疫的对照组（n=4）和经EV71灭活疫苗免疫的疫苗免疫组（n=4）同时接受EV71病毒攻击后,以临床观察、外周血和脑脊液的抗体和相关炎性因子监测、动物各组织器官的病理学检查分析为指标,判断动物在免疫反应过程中的病理性炎症反应.结果 疫苗免疫组婴猴的特异性中和抗体滴度达到1：32,无论病毒攻击与否,其外周血及脑脊液中的不同炎性因子均无明显变化.直接感染组在病毒攻击后,其外周血中嗜碱性粒细胞相比正常值有4～5倍的一过性上升;病毒攻击后第7天外周血中白细胞介素6（IL-6）和γ干扰素（IFN-γ）出现明显上升,直接感染组（平均数分别为18.5、12.7 pg/ml）均高于疫苗免疫组（10.2、7.6 pg/ml）.直接感染组脑脊液中IL-6达到了正常值的4～5倍,7 d时,直接感染组和疫苗免疫组分别为102.0 pg/ml和12.4 pg/ml.病理检查提示,疫苗免疫组所有动物中,中枢神经系统的各个部位及其他组织均未见明显病理改变.但在直接感染组中可见到明显的、由病毒感染所导致的病理损伤,包括神经细胞的退行性变、炎细胞浸润、血管袖套等典型的脑炎病理特征,动物支气管及肺组织也出现明显炎症反应.结论 EV71灭活疫苗可以在恒河猴婴猴体内诱导良好的免疫反应,保护恒河猴婴猴在感染EV71时,不发生严重的炎症反应和组织病理损伤.同时,EV71灭活疫苗具有良好的安全性.

肠道病毒71型灭活疫苗的规模化制备和免疫原性研究

目的规模化制备3批肠道病毒71型(EV71)灭活疫苗(人二倍体细胞),研究其免疫原性。方法在人二倍体细胞上适应的EV71毒株经灭活、纯化后,制备成为EV71灭活疫苗成品。采用0、4周2针程序,皮下注射免疫恒河猴,于第2次免疫后2、4～72周取外周静脉血分离血清进行中和抗体测定,同时于第2次免疫后8周时取外周静脉血采用γ干扰素酶联免疫斑点(IFN-γELIspot)方法检测细胞免疫应答。通过EV71毒株颅内注射乳鼠的研究方法,获得乳鼠攻毒的半数致死量(LD50),按5倍LD50对疫苗免疫母鼠所生的乳鼠攻毒,评价疫苗的动物保护效果。结果 EV71灭活疫苗免疫恒河猴后,2针免疫后2周即可诱导中和抗体的产生,其抗体水平可达到1∶32,在2针免疫后72周时中和抗体水平仍能维持在1∶16～1∶32;于2针免疫后第8周取血,疫苗组诱导产生IFN-γ斑点数[250斑点形成细胞(SFC)/1×106外周血单核细胞(PBMCs)]显著高于接种生理盐水的对照组(16SFC/1×106 PBMCs),P<0.01。EV71疫苗对小鼠—乳鼠免疫的保护性研究结果表明,接种EV71疫苗后,在5倍LD50攻毒情况下,对乳鼠的保护率达到100%。结论规模化生产制备以人二倍体细胞作为细胞基质的EV71疫苗,具有较好的免疫原性。

EV71灭活疫苗(人二倍体细胞)在恒河猴婴猴模型中的免疫保护性分析

肠道病毒71型作为引起儿童群体常见传染性手足口病（HFMD）的主要病原，具有导致少量感染个体出现脑炎等神经系统病变以及相关心肺功能衰竭的病理学特性．因此其预防性疫苗的研发具有重要的公共卫生意义．在前期工作的基础上，一种EV71灭活病毒疫苗（人二倍体细胞）在本研究中基于恒河猴婴猴模型进行了相应的免疫保护性分析．以160EU剂量对2～3月龄婴猴进行0，4周免疫后，动物在第4周接受了剂量为10。～CCID50的病毒经呼吸道的攻击．对病毒攻击后动物在14天内的临床症状、血液生物学、器官病原学分布以及病理学检测的动态观察表明，经疫苗免疫的动物未出现对照动物所具有的特征性临床表现，其血液生物学及病理学检测均无异常．同时，器官病原学分布亦呈阴性．结合动物中和抗体的明确增长及对照动物的综合表现分析，本文的工作证实了该EV71灭活病毒疫苗（人二倍体细胞）在恒河猴婴猴体内的免疫保护性．

人结缔组织生长因子(CTGF)对大鼠烫伤创面愈合的影响

研究人体结缔组织生长因子(CTGF)对大鼠烫伤创面愈合的影响,观察其对烫伤创面的促进愈合作用,以评估其药物有效性.在每只SD大鼠上烫2个圆形创面,制成深Ⅱ度烫伤模型,对其中一个创面涂抹CTGF,另一创面涂抹生理盐水做对照,每天2次,每天用游标卡尺量取每个创面横轴和纵轴直径,15 d后处死大鼠,取创面组织标本做病理检查,计算创面愈合百分率.CTGF对结缔组织具有促进生长作用,可加快皮肤创伤的愈合.

一株引起手足口病重症感染的柯萨奇B3病毒变异株的生物学分析

目的分析1株柯萨奇病毒B3型（CoxB3）新分离株FY-19的基因特性和生物性状，为进一步探讨其引起手足口病（HFMD）重症表现的机理提供线索。方法采用Lim Benyesh-Melnick组合血清方案对1株分离自2008年中国阜阳地区重症HFMD男性患儿的FY-19病毒株进行血清学鉴定，以全基因序列测定分析该病毒株的遗传特征，结合病毒增殖动力学和噬斑形成实验分析FY-19病毒的生物学特性，通过乳鼠脑内病毒接种研究该毒株的致病性特征。结果血清学鉴别确定FY-19毒株为CoxB3病毒；与标准株相比，FY-19株在3’、5’非编码区和编码区的差异分别为达到23．0％、16．5％和32．1％，与我国分离于非HFMD患者的毒株相比也存在较大差异（非编码区和编码区的差异分别为13．5％和25．0％）；FY-19株能在14h内达到增殖高峰，且其在小鼠体内引起心肌病变的致病性显示出明显的致死能力。结论FY-19株的生物学特性与标准毒株之间存在较大的差异，对该变异株的进一步分析将为了解其在HFMD的特殊的致病机理提供帮助。

氢氧化铝佐剂吸附肠道病毒71型灭活病毒的特性

目的探讨氢氧化铝佐剂吸附肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)灭活病毒的特性。方法采用透射电镜、凝胶排阻层析高效液相色谱(size exclusion chromatography HPLC,SEC-HPLC)及动态光散射(dynamic light scatter,DLS)技术分析灭活EV71颗粒的形态、纯度及粒径分布,并以透射电镜观察氢氧化铝佐剂纳米颗粒形态。以灭活EV71抗原含量(4000、6000、8000、10000、11000、12000、13000、14000、20000、30000 U/mL)、氢氧化铝佐剂浓度[0.35、0.25、0.17、0.085 mg/mL(按铝含量计)]、吸附时间(0、30及120 min)、离子强度(NaCl浓度0.15、0.75和1.25 mol/L)及磷铝摩尔比(P/Al,0.15、0.64、2.08及7.87)为变量,考察氢氧化铝佐剂吸附灭活EV71抗原后所呈现的吸附特性。结果灭活EV71颗粒主要以完整的病毒颗粒形式存在,直径约30 nm;氢氧化铝佐剂具有纳米化的特征,粒径分布在200~700 nm之间。≤11000 U/mL浓度的灭活EV71抗原可被0.35 mg/mL(按铝含量计)的氢氧化铝佐剂完全吸附,上清中未检测到游离抗原,从12000 U/mL起,随抗原量的增加,上清中游离抗原含量也增加;各浓度氢氧化铝佐剂能完全吸附250 U/mL的灭活EV71抗原,上清中未检测到游离抗原,不同孵育时间的吸附效果一致。在单剂量疫苗氢氧化铝含量(0.35 mg/mL,按铝含量计)及灭活EV71抗原含量(250 U/mL)条件下,NaCl离子强度对灭活EV71吸附无影响,而磷酸离子浓度明显影响吸附。结论单剂量疫苗中的氢氧化铝佐剂可完全吸附灭活EV71抗原,基团置换在其中发挥了重要作用。

RNAi技术对EV71病毒感染恒河猴星状胶质细胞所需细胞磷酸酶谱的分析

肠道病毒71型(EV71))已被证明是引起近年来亚洲-太平洋地区频发的手足口病重症并导致患者死亡的最主要病原体.但是,其是如何感染神经系统并导致严重神经系统病理损伤的分子机制尚不明确.在前期针对EV71感染星状胶质细胞的研究工作基础上,本研究利用针对恒河猴细胞内磷酸化/去磷酸化系统的共212个磷酸酶基因的siRNA库,分别下调了分离自恒河猴大脑并经纯化培养的星状胶质细胞内相应的磷酸酶的表达,并在此背景条件下比较了EV71在该细胞中的增殖特征,并对若干可以通过其表达水平及其活性的变化而直接影响EV71增殖的磷酸酶做了进一步分析.结果表明,恒河猴星状胶质细胞中若干与调控信号通路相关的酪氨酸磷酸酶和丝/苏氨酸磷酸酶对EV71的增殖具有调控作用,而病毒亦可能通过与这些磷酸酶的相互作用对所感染的星状胶质细胞的免疫反应性产生相应的影响.