骨关节炎关节软骨自然退变过程中Dvl2及β-catenin表达变化

目的探讨Dishevelled(Dvl)和β-catenin在骨关节炎(osteoarthritis,OA)关节软骨细胞自然退变中的表达情况。方法将膝关节置换的OA患者关节软骨细胞进行体外分离培养,采用自然传代的方法建立关节软骨退变模型。倒置显微镜观察P2、P6代关节软骨细胞的形态,流式细胞仪检测软骨细胞的凋亡情况。利用Q-PCR及Western blot法检测Dvl2和β-catenin基因和蛋白的表达情况。结果成功分离并进行体外培养OA患者关节软骨细胞。P2代关节软骨细胞呈三角形或多角形;P6代时形态则变为梭形,并出现明显的纤维化。P6代时凋亡率(16.34%)显著高于P2代的凋亡率(8.63%)。P2代Dvl2的m RNA相对表达量为P6代的3.629倍(P=0.004),蛋白表达量为P6代的2.548倍(P=0.03),β-catenin的m RNA相对表达量为P6代的5.087倍(P=0.001),蛋白表达量为P6代的4.4倍(P=0.003)。结论 OA关节软骨细胞在体外自然退变过程中,凋亡增多,Dvl2及β-catenin表达则呈下降趋势。Dvl及Wnt/β-catenin在软骨细胞中的功能有待进一步研究。

Dishevelled 2对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞血管内皮生长因子表达的影响

目的 对RA成纤维样滑膜细胞（FLS）体外分离培养方法进行优化,观察Dishevelled 2 （Dvl 2）在RA-FLS中对血管内皮生长因子（VEGF）分泌的影响.方法 将行膝关节置换的RA患者滑膜剪碎,利用优化的组织块法进行RA-FLS体外分离培养.构建Dvl 2慢病毒过表达质粒,转染后利用Q-PCR及ELISA检测VEGF mRNA及蛋白表达情况.然后再将转染后RA-FLS予TNF-α重组蛋白10 ng/ml刺激24h,再次检测VEGF mRNA及蛋白表达情况.采用两独立样本t检验进行统计分析.结果 成功将RA-FLS分离并进行体外培养.当感染复数为30并配合使用适当浓度的polybrene促进转染即可满足实验要求,Dvl 2的mRNA较空病毒对照组升高79倍.与空病毒对照组相比,Dvl 2对RA-FLS分泌VEGF有轻度抑制作用;TNF-α刺激后,Dvl 2达表达组VEGF的mRNA[（2.15±0.10）倍,（2.92±0.47）倍,t=-3.924,P=0.003]及蛋白[（285±100） pg/ml,（155±61） pg/ml,t=-2.714,P=0.022]均低于空病毒对照组.结论 Dvl 2可抑制TNF-α对RA-FLS分泌VEGF的促进作用,具体机制有待进一步研究.

改良经皮球囊导管法建立山羊急性脊髓损伤模型

目的 探讨应用经皮穿刺技术向椎管内置入球囊导尿管致急性脊髓压迫性损伤动物模型的方法.方法 12只崇明山羊分为对照组（A组）、0.5 ml压迫组（B组）和1 ml压迫组（C组）.选择腰-骶椎板间隙体表投影处为穿刺点,局麻后使用血管经皮穿刺鞘管,将5Fr球囊导尿管输送至硬膜外腔,透视下确认导尿管头端到达T6水平.1周后分别以0.5和1 ml容量扩张B、C组导尿管球囊,持续压迫脊髓30 min后撤除.各组动物均在穿刺操作及球囊扩张前后接受CT和MRI检查,计算球囊导管的椎管侵占率,并采用改良Tarlov评分评估神经功能.分别于球囊扩张后48 h及72 h处死每组各2只动物,取压迫节段脊髓送检病理.结果 所有动物均顺利置管.CT测得置管后A～C组椎管侵占率依次为6.8％±0.7％、6.7％±0.7％和6.6％±0.6％.扩张球囊后B、C组椎管内侵占率分别增加到43.4％±2.5％和88.1％ ±2.3％;MRI提示球囊扩张后对脊髓腹侧右侧半形成压迫.置管后各组动物神经功能无明显受损,球囊扩张后B、C组出现后肢运动障碍.除A组外,病理检查显示球囊扩张压迫48 h后,相应节段脊髓呈现灰质内神经元胞体缩小,数量减少,胞体周围间隙增大,白质轻度脱髓鞘,部分轴突空泡样变;压迫72 h后病理改变明显加重.结论 球囊扩张后神经、影像和病理学的评估结果符合急性脊髓压迫性损伤的特点.经皮穿刺置管技术能够避免破坏脊髓正常生理环境,模拟符合临床实际的闭合损伤机制,是一种可行性较高的脊髓损伤建模方法.

巢乱蛋白2及JAK-STAT通路对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡的影响

目的探讨巢乱蛋白（DVL）是否通过JAK-STAT通路来调控类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞（RA-FLS）的凋亡。方法将DVL2过表达慢病毒转染入RA-FLS后通过流式细胞仪检测细胞的凋亡率；通过RNA-seq检测DVL2对RA-FLS信号通路的影响，并利用RT-PCR对通路上的重点基因和下游的抗凋亡基因进行验证。结果与空载慢病毒对照组（Control）相比，DVL2可以明显增加MH7A细胞的凋亡率（3.2%±2.2%及25.7%±4.5%）。RNA-seq结果显示，DVL2可以下调JAK-STAT通路中的相关基因，利用RT-PCR进一步验证发现DVL2可以抑制JAK2、Stat1和Stat2基因的表达，加入肿瘤坏死因子（TNF）-α刺激后DVL2可以明显抑制JAK2和Stat2基因的表达但对Stat1的抑制作用不明显；DVL2可以抑制Bcl-xL基因的表达，加入TNF-α刺激后对Bcl-2和Bcl-xL均有明显抑制作用。结论DVL2可以抑制JAK-STAT通路及其下游的抗凋亡基因的表达促进RA-FLS的凋亡。

巢乱蛋白2在类风湿关节炎软骨中的表达及其对软骨破坏的影响

目的 探讨巢乱蛋白2 （DVL2）在类风湿关节炎（RA）膝关节软骨中的表达及其对软骨破坏的影响.方法 Western blot检测类风湿关节炎（RA）和骨关节炎（OA）患者及胶原诱导关节炎（CIA）大鼠和健康大鼠膝关节软骨中DVL2蛋白表达.将DVL2过表达慢病毒转染入CIA大鼠膝关节后,观察其对CIA大鼠关节软骨的影响;将DVL2过表达慢病毒转染入RA患者膝关节软骨细胞后,实时定量-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测软骨细胞中细胞因子基因的表达.结果 RA患者膝关节软骨组织中DVL2蛋白表达高于OA患者（2.04±0.76比0.97±0.37,t=2.815,P=0.044）.CIA大鼠膝关节软骨中DVL2蛋白表达高于健康大鼠（2.18±0.68比0.92±0.05,t=2.921,P=0.042）.转染DVL2过表达慢病毒后对CIA大鼠膝关节软骨的破坏无显著影响（P=0.885）.转染DVL2过表达慢病毒后,可上调RA患者膝关节软骨细胞中环氧合酶2（COX-2）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-3、MMP-9mRNA表达,当加入肿瘤坏死因子α（TNFα）刺激后,COX-2、iNOS、MMP-2、MMP-3、MMP-9mRNA表达更为明显.结论 DVL2在RA患者关节软骨中处于高表达,并通过激活Wnt/β-catenin通路促进软骨细胞破坏相关基因表达,从而参与RA关节软骨的破坏.