细菌的活的非可培养状态

在微生物生态学研究中已经知道并非自然界所有细菌都能用人工培养方法分离培养出来,尤其在水环境中,直接显微镜镜检计数细菌总数往往比常规培养法计数(包括平板法和MPN法)高许多倍,而导致这种现象的原因并不十分清楚。近年来。

应用固定化硫杆菌防除海洋污着生物的初步研究

海洋污着生物附着生长在船底、海上工程设施的表面,给人类在海上的经济活动造成巨大损失。长期以来,防除海洋污着生物的主要措施是涂覆含毒物的防污漆。毒物主要是铜、汞、砷和锡的化合物,通过漆膜的慢性渗出,毒杀污着生物的幼虫或孢子。有毒防污漆虽然有效,但却日益污染海洋生态环境。70年代初有人报导了无毒防污漆的设想与研究,即防污漆未必杀死污着生物的幼虫或孢子,却能阻止其附着。当物体浸没入海水以后,细菌首先附着在物体的表面上并生长繁殖,然后硅藻、真菌、原生动物及其他微型藻类相继附着,形成一层微生物粘膜。

花鲈弧菌病病原菌(哈维氏弧菌)的分离与鉴定

1999年 4～ 5月 ,山东省青岛市胶南海区网箱养鱼场花鲈 (Lateolabraxjaponicus)幼鱼发生暴发性传染病 ,死亡率达 5 0 %。从具有明显症状的病鱼的病灶组织分离到 1株优势菌SF 1,经人工感染和从人工感染发病的花鲈再分离的SF 3菌株的再感染试验结果表明 ,所分离的菌株为此次花鲈烂尾病的致病菌。经形态、生理生化等 64项特征指标鉴定 ,SF 1和SF 3均为哈维氏弧菌 (Vibrioharveyi)。药敏试验结果表明 ,头孢噻肟、头孢三嗪、头孢孟多、呋喃妥因、氯霉素、氧哌嗪青霉素、磺胺类、复方磺胺、三甲氧苄氨嘧啶、多粘菌素E等

鳗弧菌口服微胶囊疫苗的制备及其对鲈鱼的免疫效果

以分离自患病鲈鱼 (Lateolabraxjaponicus)的致病菌W - 1为材料 ,利用喷雾微胶囊技术制备口服微胶囊疫苗。结果表明 ,喷雾干燥条件对疫苗微胶囊颗粒影响较大 ;其适宜条件为 :进料温度 4 0℃ ,进料速度 4 0ml/min ,热风温度 2 0 0℃ ;其制备的微胶囊疫苗平均粒径为 4 5.5μm ,平均含菌量为 2 .79× 10 9mg- 1干粉。将此微胶囊疫苗及全细胞疫苗直接拌入饵料口服免疫接种鲈鱼幼鱼 ,1周后以W - 1活菌攻毒 ( 2 .5×10 6CFU /尾 )。结果表明 ,微胶囊疫苗组的 1周累积死亡率 ( 4 1.7% )低于全细胞疫苗组 ( 4 5.0 % ) ,均低于对照组 ( 95.0 % )。 2个免疫组都有一定的免疫保护力 ,微胶囊疫苗组和全细胞疫苗组的免疫保护力分别为56.1%和 52 .6%。

海洋有益菌的筛选与鉴定

从健康的斑节对虾 (Penaeusmonodon)幼体及其养殖环境中分离到 2 13株海洋细菌 ,采用十字交叉划线法和琼脂扩散法进行体外拮抗试验 ,从中筛选到 5株对水产养殖动物病原哈维氏弧菌 (Vibrioharveyi)和鳗弧菌 (Vibrioanguillarum )等菌株生长有抑制作用的海洋细菌。根据其形态特征以及生理生化反应特征 ,初步鉴定为交替单胞菌属(Alteromonas) ,其中菌株A18鉴定为橙色交替单胞菌 (Alteromonasaurantia)。

虾池有机污染物降解细菌的筛选

在实验室条件下对 6 12株海洋细菌和 10株海水驯化淡水菌进行筛选 ,检测其快速降解水体中富营养有机物的能力。利用对虾饵料培养基、BOD仪、胞外酶检测等方法进行筛选 ,最后筛选到 10株对富营养有机物具有较高降解性能的细菌。所有的细菌均能产生明胶酶和脂酶 (Tween - 80 ) ,其中 9株细菌能产生淀粉酶 ,8株产生卵磷脂酶 ,2株产生酪蛋白酶 ,1株产生褐藻胶酶。通过测量BOD来衡量 10株细菌利用对虾饵料的效果 ,2天时能消化 46 .6 %～ 5 9.5 %的对虾饵料 ,5天时能消化 5 0 .8%～ 70 .2 %的对虾饵料。用常规生理生化方法将细菌鉴定到属 ,其中 3株为弧菌属细菌 (Vibriospp .) ,3株为假单胞菌属细菌 (Pseudomonasspp .) ,2株为发光杆菌属细菌 (Photobacteriumspp .) ,1株为气单胞菌属细菌 (Aeromonasspp .) ,1株为枯草杆菌 (Bacillussubtilis)。

中国对虾病原菌及其致病机理的研究

本研究证实副溶血弧菌、溶藻胶弧菌和坎贝氏弧菌,可引起养成期中国对虾暴发红腿病。该病系病原菌侵入对虾循环系统而导致的败血症。副溶血弧菌、溶藻胶弧菌的胞外产物具有多种酶活性,是病虾致死的主要原因。

弧菌拮抗菌的筛选

用平板划线或点种法对 6 0 2株海洋细菌进行筛选 ,得到 4株对海水养殖动物 (鱼、虾、贝 )的病原菌有拮抗作用的细菌。并对拮抗菌 QJ2的拮抗作用进行了研究 ,结果为 :QJ2有广泛的弧菌抗菌谱 ,对 37株弧菌的抗菌阳性率达到 89.2 % (33/ 37) ;用活菌平板计数法和 O.D.60 0 nm研究了QJ2培养物的去细胞上清液 (CFS)与病原菌 W- 1的作用动力学 ,15min时 W- 1的细菌数便开始减少 ,4 h时细菌数最少 ,6 h后开始增加 ,而对照组的细菌数呈逐渐上升趋势 ;QJ2对自身的拮抗物质不敏感 ;QJ2抗性物质的分子量不大于 80 0 0 Da;经常规生理生化方法和 API- 2 0细菌快速鉴定系统鉴定 ,QJ2为气味黄杆菌 (Flavobacterium odoratum)。

有益细菌A18在海湾扇贝(Argopecten irradians)育苗中的应用

在海湾扇贝D形幼虫期施用 10 3 ,10 4 ,10 5CFU/ml三个浓度的有益细菌A18。经该菌处理后 ,扇贝幼苗的变态率与各个发育期的成活率均比加氯霉素组和未加任何处理的对照组高。其中以 10 4 CFU/ml处理的扇贝幼苗的变态率和成活率最高。对实验扇贝幼苗水体细菌总数和弧菌数分析发现 ,经 10 5,10 4 CFU/mlA18菌处理水体的细菌总数和弧菌数均比相应的对照组低。在扇贝育苗水体加入 10 6,10 7,10 8CFU/ml的有益细菌A18,检测高浓度A18对扇贝幼苗的毒害作用 ,当该菌浓度在 10 6CFU/ml时 ,经 4 8小时扇贝幼苗成活率 79% ,高于对照组的 6 8 5 % ;当浓度达 10 7,10 8CFU/ml时 ,处理 4 8小时后的扇贝幼苗死亡率分别为 95 6 %和 10 0 %。

鲈鱼鳗弧菌病疫苗的制备及免疫防治效果

以从患出血、烂尾病的鲈鱼 ( L ateolabrax japonicus)中分离的 1株致病性鳗弧菌 W- 1( Vibrio anguillarum)为材料 ,进行了鳗弧菌全细胞灭活疫苗研制 ,比较了福尔马林、苯酚、氯仿等不同灭活剂在不同温度下的灭活效果。最终确定以 0 .5 % ( v/ v)的福尔马林溶液在 2 8℃下处理 4 8h为最佳灭活条件 ,所用的菌悬液浓度为 2 .5× 10 9cfu/ m L。用福尔马林灭活的 W- 1( Vibrio anguil-larum)疫苗 ,分别浸泡免疫鲈鱼苗和注射成鱼 ,并检测了疫苗对鱼体的免疫保护力。结果表明 ,经疫苗浸泡免疫 4周后的鲈鱼苗免疫保护力达 64.7% ,90 d后同批次的鲈鱼再注射免疫 ,其免疫保护力为 78.9% ,血清中抗体凝集效价为 1∶ 192。仅进行注射免疫组 ,其免疫保护力为 5 7.9% ,血清中抗体凝集效价为 1∶ 2 2 4。

中国对虾弧菌病的间接荧光抗体诊断技术研究

于1994年8月—1995年5月建立中国对虾病原菌──副溶血弧菌的间接荧光抗体检测技术，其中副溶血弧菌的特异抗血清由家兔制备，羊抗兔免疫球蛋白用异硫氰酸荧光素标记，并以罗丹明标记的牛血清白蛋白为背景染色。应用该技术在山东省莱州市大华水产实业公司养殖场检测中国对虾样品中的副溶血弧菌。结果表明，养成期人工感染对虾中，副溶血弧菌主要集中于中国对虾的注射点附近的肌肉及血淋巴中，说明由肌肉注射而进入体内的病原菌主要转移部位是血淋巴；菌浴感染苗期中国对虾中，尽管虾苗外观未见异常，但可检测到大量副溶血弧菌；苗期对虾中的副溶血弧菌现场检测，3组发病虾苗样品中均检测到副溶血弧菌，3组外观健康的虾苗样品中，其中1组样品中检测到副溶血弧菌，另外2组样品未检测到副溶血弧菌，表明间接荧光抗体技术不仅可用于诊断发病的感染对虾，也可用于检测带菌状态或未发病的感染对虾。

鲈鱼苗烂鳃、烂尾病病原菌的研究

１９９７年４～５月，对花鲈（Ｌａｔｅｏｌａｂｒａｘｊａｐｏｎｉｃｕｓ）鱼苗期细菌性烂鳃和烂尾病的病原菌进行了研究。从具有明显症状的病鱼的病灶组织分离到２株致病菌Ｃ－１和Ｗ－１，经人工感染及从人工感染发病鱼体再分离的Ｗ－４和Ｗ－５菌株的再感染试验结果表明，所分离的细菌为鲈鱼苗烂尾，烂鳃病的致病菌。经６４项生物学特性，生理生化特征测试结果表明，这４株菌可归为一类，同属于鳗弧菌（Ｖｉｂｒｉｏａｎｇｕｉｌａｒｕｍ）。药敏试验结果表明，痢特灵、ＣＩＮ１００、ＭＥＬ２５、呋喃妥因、氯霉素、磺胺药＋ＴＭＰ和美洛西林等７种药物对病原菌有显著的抑制作用。

应用间接ELISA技术快速检测花鲈病原菌-鳗弧菌

以花鲈 (Lateolabraxjaponicus)弧菌病的病原菌———鳗弧菌 (Vibrioauguil larum)W 1为抗原 ,制备兔抗血清 ;利用辣根过氧化酶标记的羊抗兔血清 (HRP IgG)为酶标二抗 ,建立了检测鳗弧菌的间接ELISA快速检测法。结果表明 ,应用间接ELISA技术检测鳗弧菌有较高的灵敏度 ,最低的检测量为 10 5个 /ml,即 10 4 个 /孔。同时交叉反应表明其具有较高的特异性。对 4 6份人工感染后的花鲈组织样品 ,包括肌肉、鳃、肠、肝、肾等组织的检测表明 ,阳性检测率为 76 .1%。

细菌糖蛋白对螯虾免疫因子的影响

实验检测了气味黄杆菌的胞外糖蛋白对克氏原螯虾（Ｐｒｏｃａｍｂａｒｕｓ ｃｌａｒｋｉｉ）的几种非特异性免疫困子一凝集素、酚氧化酶、溶菌、抗菌和超氧化物歧化酶等活力的影响。注射１０ ｍｇ糖蛋白后，实验组螯虾血清的免疫因子活力均高于对照组，凝集素活力在第１～４天最高；酚氧化酶在第１～５天维持较高活力，最大活力在第 ２天，溶菌、抗菌活力在第 １～ ６天维持较高水平，分别在第 ３天、第 ２天达到最大。与对照组相比，实验组螯虾肌肉的溶菌和抗菌、超氧化物歧化酶活力没有明显的变化。结果表明：气味黄杆菌的胞外糖蛋白可增强螯虾血淋巴的凝集素、酚氧化酶、溶菌和抗菌活力。

鳗弧菌灭活疫苗对海水养殖大菱鲆的免疫预防研究

福尔马林灭活的鳗弧菌疫苗分别以浸泡、注射接种的方式对海水养殖大菱鲆鱼苗进行免疫，定期检测血清中特异性抗体。4周后用鳗弧菌悬液(3．7×10^8cfu／m1)0．2ml腹腔注射感染免疫鱼。结果表明，灭活鳗弧菌疫苗用2种方式免疫后都能刺激大菱鲜产生特异性免疫反应。其中注射免疫组在1周后即可产生特异抗体，在6周内一直呈上升趋势，最高达1228．8，免疫4周后人工感染后的免疫保护力为91．70％。浸泡免疫组在3周后才产生抗体凝集价，凝集抗体效价最高36，免疫保护力为33．30％。

虾池养殖环境有机污染物降解细菌的筛选

在实验室条件下通过富集培养共分离出 1 2 1株菌进行筛选。利用需氧性、BOD2 / COD0 、胞外酶等指标进行筛选 ,最后筛选到 7株对富营养有机物具有较高降解能力的细菌 ,它们均能产生酪蛋白酶、明胶酶、脂酶 (Tween- 80 )、淀粉酶其中 4株细菌还能产生卵磷脂酶。通过测定 BOD5及 COD来衡量 7株细菌利用对虾饵料的能力 ,5d内对虾饵料培养基的 CODMn去除率达到 59.6%～ 79.2 %。用常规生理生化方法将细菌鉴定到属 ,其中 1株为弧菌属细菌 (Vibrio spp.) ,6株为芽孢杆菌属细菌(Bacillusspp.)。

对虾病原菌抑菌药物的研究

应用药敏纸片法研究了48种化学疗剂对中国对虾红腿病病原菌(包括Vibrio alg-inolyticus,V.campbellii,V.parahaemolyticus,Proteus vulgaris及未确定的海洋弧菌)生长的抑制作用,其中氯霉素(30μg/片)、磺胶药+TMP(25μg/片)和呋喃妥因(200μg/片)抑菌力最强、抑菌谱最广;红霉素(15iu/片)、土霉素(30μg/片)无明显抑菌作用。对27种中草药水浸液以平板点种法试抑菌作用。结果表明乌梅、石榴皮、五味子的水浸液具有较强的抑菌活性,可用于配制防病药物饵料。5,7—二氯-8-羟基喹啉对多种病原菌有较强的抑菌作用,药物平板点种法最小抑菌浓度为25mg/L,药浴法有效抑菌浓度低于5mg/L。

细菌QJ2对对虾病原性哈维氏弧菌的拮抗作用

对气味黄杆菌（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ ｏｒｄｏｒａｔｕｍ） ＱＪ２及其去细胞上清液（ＣＦＳ）对对虾病原性哈维氏弧菌（Ｖｉｂｒｉｏｈａｒｖｅｙｉ）Ｚ３Ｇ２ Ｅ０２２的拮抗作用进行了研究。ＱＪ２的ＣＦＳ对病原菌表现显著的拮抗性能，在６ｈ内使数量为１０５－１０６ｃｆｕ·ｍＬ的病原菌（Ｚ３、Ｅ０２２均降为０。经热、酸碱、蛋白酶处理的ＣＦＳ，抑菌活性均有不同程度下降，结果为；经６０℃处理以６０ｍｉｎ的ＣＦＳ，经６ｈ使Ｚ３Ｇ２细菌数降为０，经１５ｍｉｎ使Ｅ０２２数量降为最低，为初始菌数的６３．０％：经１００℃处理１０ｍｉｎ，ＣＦＳ使Ｚ３Ｇ２和Ｅ０２２数量分别在１ｈ和１５ｍｉｎ降为最低，各为初始菌数的２３．７％和７２．１％；经ｐＨ４时作用３０ｍｉｎ，ＣＦＳ使Ｚ３Ｇ２和Ｅ０２２数量分别在１５ｍｉｎ和１ｈ降为最低，各为初始菌数的８８．３％和１５．９％，而经ｐＨ１２处理３０ｍｉｎ后，ＣＦＳ没有使病原菌数下降，但使病原菌以比对照组细菌低的速率缓慢上升；经蛋白酶Ｋ于３７℃作用６０ｍｉｎ后，ＣＦＳ在１５ｍｉｎ时使Ｚ３Ｇ２和Ｈ０２２数量降为最低，各为初始菌数的１５．０％和６６．１％。在人工水体中，ＱＪ２活菌对病原菌也具有显著的拮抗?