重组B群脑膜炎球菌疫苗大鼠安全性和免疫原性研究

目的 对大鼠重复给予重组B群脑膜炎球菌疫苗,考察该创新疫苗的非临床安全性和免疫原性,为临床设计人用剂量及临床毒副反应的监测提供参考依据。方法 使用SD大鼠,设计阴性对照组、佐剂对照组、疫苗低剂量组(每只1剂)和高剂量组(每只3剂)4个主试验组及3个卫星组。于第0、3、6、9、12周分别肌肉注射,进行临床观察和解剖观察,并对多种组织脏器进行病理学检查。检测体质量、食量、体温、血细胞计数、凝血功能、血液生化、眼科、T淋巴细胞亚群、细胞因子、血清特异性IgG抗体和杀菌抗体等指标。结果 低、高剂量重组B群脑膜炎球菌疫苗均能产生高水平的结合抗体,免疫血清具有较强活性的杀菌抗体。低、高剂量组疫苗可引起大鼠中性粒细胞、单核细胞及淋巴细胞显著升高,血红蛋白和红细胞比容显著降低。与给药相关的改变还表现为血清球蛋白升高,白蛋白降低,与之伴随的A/G值降低。4周恢复期后均可恢复正常。与佐剂和疫苗免疫相关的组织病理学改变为注射局部可见轻微至中度肉芽肿性炎症、急性炎症,坐骨神经外膜单个核细胞/混合细胞浸润、增生,淋巴结髓索浆细胞数目及粒细胞系增多等。结论 重组B群脑膜炎球菌疫苗对SD大鼠具有良好的免疫原性和安全性,未见免疫毒性反应,可见与铝佐剂和免疫反应相关的外周血液指标变化以及注射部位炎症。本试验剂量下,重组B群脑膜炎球菌疫苗未见不良反应剂量(no observed adverse effect level, NOAEL)为每只3剂。

H因子结合蛋白抗原含量双抗夹心ELISA检测方法的优化与应用

目的优化双抗夹心-酶联免疫吸附法(double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay,DAS-ELISA)检测H因子结合蛋白(factor H-binding protein,fHBP)抗原含量的方法,并将其应用于重组B群脑膜炎球菌疫苗体外相对效力评价。方法筛选4种抗fHBP单克隆抗体(monoclonal antibodies,McAb)适宜的抗体组合,通过方阵滴定法确定适宜的捕获抗体和酶标检测抗体稀释倍数、包被液、包被条件和显色时间,对优化后方法的专属性、线性、检测限、精密度和准确度进行了验证,并利用该方法检测fHBP蛋白相关制品的抗原含量。结果确定了适宜的双抗体检测组合以及试验条件(以柠檬酸缓冲液,4℃孵育16 h),在以柠檬酸缓冲液包被捕获抗体5.0000μg/mL、检测抗体1∶2000稀释、显色时间15 min的条件下,A450 nm-fHBP浓度曲线相关系数(r)>0.98,平行孔CV<10%,检测限<0.0002μg/mL,精密度<15%,准确度(直接回收率)<20%。亚家族之间抗原检测无干扰。多批fHBP相关制品检测结果稳定,差异无统计学意义(P>0.05)。结论优化后的方法可用于fHBP抗原含量的检定。

H因子结合蛋白单克隆抗体的制备及ELISA法含量检测初探

目的:制备B群脑膜炎球菌H因子结合蛋白A(fHBP A)和H因子结合蛋白B(fHBP B)亚家族的单克隆抗体,建立检测fHBP抗原含量的ELISA方法。方法:重组表达并纯化fHBP A(His)和fHBP B(His)标签蛋白免疫小鼠,将小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选3株稳定分泌抗fHBP单克隆抗体的细胞株A,B和AB。以抗AB为一抗,辣根过氧化物酶标记抗A、抗B为二抗,分别建立检测fHBP A和fHBP B的双抗夹心ELISA方法。结果:3种单抗效价均在4.4×10^(5)~8.8×10^(5),Western Blot及ELISA显示3种抗体均有结合特异性,且单抗AB和A,B对应不同的抗原识别位点,相互独立。双抗夹心ELISA方法灵敏度达到10 ng·mL^(-1),变异系数<10%。结论:采用单克隆抗体检测fHBP抗原的ELISA方法特异性和适用性良好,为进一步建立快速灵敏检测和鉴定fHBP抗原的方法奠定了基础。

B群脑膜炎球菌重组H因子结合蛋白的免疫原性研究

目的:通过检测血清抗体滴度和杀菌抗体检测(SBA)评价重组H因子结合蛋白(factor H binding protein,fHBP)的免疫原性。方法:选择并合成fHBP序列,连接至pET43.1a质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),表达两个亚家族的重组fHBP蛋白,fHBPA和fHBPB,经过纯化后免疫家兔和小鼠,通过ELISA和SBA试验检测免疫抗血清效价和B群脑膜炎球菌流行菌株的杀菌滴度。结果:fHBP免疫兔血清效价均大于2.0×10^(6),免疫小鼠血清效价高于1.0×10^(6)。69株流行株SBA试验中fHBP免疫兔血清对41株A亚家族和20株B亚家族均有大于1∶128杀菌滴度,亚家族靶菌之间没有交叉保护作用。fHBPA小鼠血清对A亚家族流行株Nm210902、Nm211009、Nm450522平均滴度为1∶1024、1∶608、1∶861,对Nm510703、Nm311304、Nm431002流行株的滴度为1∶234、1∶861、1∶430;fHBPB小鼠血清对B亚家族流行株Nm311302、Nm311113和Nm321114的杀菌滴度分别是1∶2896、1∶1878和1∶430。而fHBPA和fHBPB混合蛋白质免疫鼠血清Nm210902、Nm510703和Nm311302平均滴度分别1∶876、1∶274、1∶1858,对3株靶菌均存在有效杀菌。结论:fHBP免疫抗血清效价均在1.0×10^(6)水平以上,对61株B群流行株的杀菌滴度大于1∶128,对69株B群脑膜炎球菌流行株有94.2%的保护效果。