新冠感染者康复期血浆中高效价新冠病毒IgG抗体检测的ELISA试剂盒筛选

目的通过对ELISA-IgG试剂盒检测不同时期采集的单份康复期血浆及病毒中和实验检测不同效价的混合血浆的结果进行比较与分析,确定能用于高效价新冠病毒IgG抗体筛查的试剂盒。方法用A、B两种不同厂家ELISA-IgG试剂盒同时检测2020年2月~2022年1月采集的269份康复期血浆,分析两者结果的相关性及符合率,初步确定试剂盒;按照初步选定的试剂盒的系列稀释标准品效价,分档位制备5档混合血浆小样G4~G128,同时用厂家A和厂家B的ELISA试剂盒以及原始株、Omicron变异株BA.1和BA.2株的假病毒中和实验检测,分析结果的相关性,结合强阳性样品的孔外稀释倍数,确定可用于筛选高效价新冠病毒IgG抗体的试剂盒。结果以内控参考品B2为标准品,厂家A检测敏感度为1∶32,厂家B检测敏感度为1∶8,厂家A的检测敏感度是厂家B的4倍;两个试剂盒检测269份血浆结果的相关性Pearson r为0.9441,P<0.0001;初步选定敏感度较低的厂家B为备选试剂盒。混浆小样结果分析显示,厂家A结果与厂家B结果的相关性Pearson r为0.988,厂家A的ELISA-IgG结果与3株病毒中和抗体效价相关性r排序分别为原始株(0.978)>BA.2株(0.970)>BA.1株(0.799),厂家B的ELISA-IgG结果与3株病毒中和抗体效价相关性r排序分别为原始株(0.994)>BA.2株(0.968)>BA.1株(0.804);若以B2稀释2倍的样品为收浆标准,厂家B试剂盒的收浆合格率为55.4%(149/269),高于现用的厂家A试剂盒的收浆合格率47.2%(127/269),对于强阳性血浆,厂家B试剂盒对于样品的稀释倍数更低,更方便操作。结论厂家A和厂家B的ELISA-IgG试剂盒均符合新冠病毒株IgG抗体检测要求,其中厂家B的试剂盒更适用于高效价IgG抗体的筛选。

抗SARS-CoV-2 IgG抗体第2代内控参考品的制备及其在ELISA检测方法中适用性的评价

目的制备抗严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-Co V-2)IgG抗体第2代内控参考品(B2),并评价其在ELISA检测方法中的适用性。方法在接种北京生物制品研究所有限责任公司生产的SARS-Co V-2灭活疫苗(BBIBP-Cor V)志愿者中,初筛19份ELISA-IgG稀释倍数在20~60之间IgG抗体阳性的血浆,再采用ELISA法检测初筛血浆的IgG抗体、Ig M抗体及中和抗体,选取ELISA-IgG稀释倍数在32~45之间、Ig M阴性且中和抗体抑制率相近的非脂血血浆制备B2。用抗SARS-Co V-2免疫球蛋白第1代WHO国际标准品(NIBSC 20/136)标定第1代内控参考品(B1)、B2经ELISA法检测的中和抗体效价,并验证B2的加速稳定性(2~8℃分别放置5、8、14、20、30 d)、使用稳定性(18~25℃分别放置1、2、3 h)、冻融稳定性(1、2、3次)及长期稳定性(-25℃放置10个月)。以B2为标准品检测单份疫苗免疫后血浆,按照不同ELISA-IgG稀释倍数档位进行合并,制备不同档位的混合血浆,对混合血浆的ELISA-IgG稀释倍数与假病毒中和抗体效价进行相关性及线性回归分析。结果19份血浆中,ELISA-IgG稀释倍数在32~45之间、Ig M阴性且中和抗体抑制率接近的非脂血血浆共5份,每份血浆按等体积分数混合制备B2,其ELISA-IgG稀释倍数赋值为32。NIBSC 20/136标定的B1中和抗体效价为133.38 EIU/m L B2为122.14 EIU/m L。B2的加速稳定性、使用稳定性、冻融稳定性及长期稳定性回收率均在(100±15)%范围内。相同来源的混合血浆的ELISA-IgG稀释倍数与假病毒中和抗体效价均呈显著相关(R^(2)均>0.99,P均<0.0001)。结论以SARS-Co V-2灭活疫苗免疫后血浆为原料制备的B2可替代用COVID-19康复者恢复期血浆为原料制备的B1。

紫外-可见分光光度法检测高纯度人C1酯酶抑制剂蛋白质含量的经验公式

目的建立高纯度人C1酯酶抑制剂(C1 esterase inhibitor,C1-INH)蛋白质含量(质量浓度)检测的紫外-可见光分光光度法(简称A_(280 nm)法),得到双对数方程的经验公式,用于C1-INH精纯阶段含目标蛋白样品的蛋白质含量在线检测。方法以1批高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)纯度98.49%的C1-INH原液作为对照品,用注射用水稀释获得不同质量浓度的稀释品,分别检测稀释品A_(280 nm)值,以稀释品的A_(280 nm)值与理论质量浓度进行不同方程的线性拟合,选取回收率在理论值100%±10%、R^(2)>0.99的质量浓度区间建立最佳拟合方程。在此线性范围内,用原始值和消光值分别拟合得到不同的方程,对2种拟合方程的准确度、精密度和稳定性进行验证。通过原始值均值方程和不同基质液的检测均值来建立经验公式,用该经验公式计算不同批次纯化工艺中间样品的蛋白质质量浓度并与免疫比浊法和凯氏定氮法的检测结果进行比较,确定其准确性。用该经验公式指导C1-INH精纯样品的检测。结果建立的A_(280 nm)法采用双对数方程拟合标准曲线的线性范围为0.214~3.567 mg/mL;在此线性范围内,用原始值和消光值分别拟合双对数方程,2个标准曲线的重复性和稳定性均较好,且高、中、低值质控品及检测下限的准确度(即回收率)<100%±7%,精密度CV<3%。含目标蛋白质的多种基质液按照原始均值方程计算得到对应的蛋白质质量浓度在0.044~0.064 mg/mL,均值为0.051 mg/mL;经验公式为:蛋白质质量浓度x={10(lg(y)+0.3820.764)-0.051}×稀释倍数,用该公式计算的添加了对照品的各基质的回收率在96.636%~109.533%。检测不同批次纯化工艺中间样品的结果显示,对于精纯样品,该经验公式与凯氏定氮法的结果比值在0.93~1.12,免疫比浊法结果与凯氏定氮法的结果比值在1.19~2.33。用该经验公式计算的不同精纯阶段中间样品的结果与凯氏定氮法结果更接近。结论建立的A_(280 nm)法经验公式可用于精纯阶段的高纯度C1-INH样品的蛋白质含量在线快速检测。

用于SARS-CoV-2疫苗免疫后血浆筛选的不同ELISA试剂盒适用性评估

目的通过比较3个厂家4种SARS-CoV-2 ELISA-IgG及中和抗体检测试剂盒筛选免疫后血浆的收浆合格率并比较操作便利性,确定最佳原料血浆筛选用试剂盒。方法以从现有SARS-CoV-2疫苗免疫后血浆中筛选的不同ELISA稀释倍数档位单份血浆为原料,用不同厂家SARS-CoV-2 ELISA-IgG及中和抗体检测试剂盒进行检测,按照各厂家效价分档位进行混合。混合血浆进行假病毒中和试验,根据中和抗体效价确定不同试剂盒的收浆标准,并计算各自收浆合格率;根据收浆标准确定单份血浆筛选的稀释方式,比较操作便利性;综合判断试剂盒的适用性。结果以内控参考品B2为收浆标准,厂家B ELISA-IgG抗体检测试剂盒在1108份WT>16的血浆中收浆合格率为82.1%,高于现用厂家A ELISA-IgG抗体检测试剂盒(59.8%)。以厂家B中和抗体检测试剂盒的50 IU/mL为收浆标准,该试剂盒在387份WT16~64的血浆中收浆合格率为66.4%,高于厂家A ELISA-IgG抗体检测试剂盒的收浆合格率(42.1%)。以厂家C中和抗体检测试剂盒100 IU/mL为收浆标准,该试剂盒在536份WT16~64的血浆中收浆合格率为42.5%,低于厂家A ELISA-IgG抗体检测试剂盒的收浆合格率(50.2%)。厂家C中和抗体检测试剂盒操作步骤最多,反应时间最长;厂家B ELISA-IgG抗体检测试剂盒反应时间最短,对于WT16~64的样品无需孔外稀释,而厂家A需孔外稀释。4种试剂盒的收浆合格率差异主要发生在WT16~64的样品中,其收浆合格率在该区间排序依次为:厂家B ELISA-IgG抗体检测试剂盒>厂家B中和抗体检测试剂盒>厂家A ELISA-IgG抗体检测试剂盒>厂家C中和抗体检测试剂盒;操作便利性排序为:厂家B ELISA-IgG抗体检测试剂盒>厂家B中和抗体检测试剂盒>厂家A ELISAIgG抗体检测试剂盒>厂家C中和抗体检测试剂盒。结论从收浆合格率及操作便利性综合考量试剂盒的适用性,以厂家B ELISA-IgG抗体检测试剂盒最佳。

阴离子交换层析结合低温乙醇法制备静脉注射人免疫球蛋白及关键质量分析

目的:层析结合低温乙醇法制备静脉注射人免疫球蛋白(IVIG),检测制备过程中杂质去除效果及层析对制品质量的影响。方法:本实验系用健康人血浆,采用低温乙醇蛋白分离法分离纯化得到的组分II(以下简称FII)沉淀作为原料,经过一步阴离子交换层析制备IVIG(pH 4),检测IVIG制品分子量大小分布、免疫球蛋白(Ig)A含量、IgG含量及IgG亚型分布、蛋白质二级结构,采用孔径为20 nm的纳滤膜过滤,对比分析低温乙醇蛋白分离法及联合阴离子交换纯化工艺制备的IVIG(pH4)制品的IgA,IgM去除效果及纳米膜的通量。结果:FII沉淀经5倍注射用水溶解,搅拌2 h后的IgG溶出率较高,阴离子交换层析结合低温乙醇法制备的IVIG(pH 4)制品中IgA含量控制在100μg·mL^(-1)以内,提高了纳米膜(20 nm)病毒灭活的通量,与市售产品IgG亚型分布、二级结构一致,分子大小分布符合《中华人民共和国药典》规定。结论:阴离子交换层析可以降低产品中IgA,IgM等杂质的残留量,提高了纳米膜(20 nm)的通透性,且对IVIG制品关键质量无显著影响。

人C1酯酶抑制剂抗原含量ELISA检测方法的建立、验证及应用

目的 建立C1酯酶抑制剂(C1 esterase inhibitor, C1-INH)抗原含量的双抗体夹心ELISA检测方法,验证后用于C1-INH纯化工艺摸索。方法 用羊抗人C1-INH抗体作为捕获抗体,用过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人C1-INH抗体作为检测抗体,进行棋盘滴定初步确定捕获抗体的工作质量浓度,用西门子血浆标准品进行系列稀释作为标准品经过2轮实验来确定拟合曲线和线性范围及检测抗体的工作质量浓度,用血浆标准品标定电泳C1-INH标准品(电泳纯度>92%),分析与血浆标准品的平行性来选择本方法最终使用的标准品,最终建立了C1-INH抗原含量的双抗体夹心ELISA检测方法。对此方法进行线性、准确度、精密度、加样回收率、电泳标准品稳定性的验证。将验证后的方法用于C1-INH纯化工艺的摸索及产品质量分析,并与特定蛋白检测仪的结果进行比较。结果 捕获抗体质量浓度为400.000 ng/mL,检测抗体质量浓度为400.000 ng/mL,标准曲线采用四参数方程拟合,电泳标准品的质量浓度为0.895 mg/mL,血浆标准品作为本方法标准品;标准曲线的线性范围为1.560~100.000 ng/mL,各质量浓度标准品回收率在83.35%~112.19%,CV<15.00%,R^(2)≥0.990;不同质量浓度质控品检测结果的批内准确度在91.90%~113.14%,批间准确度在95.93%~106.10%,批内CV在1.00%~6.70%,批间CV在2.92%~6.54%。样品添加实验的回收率在93.37%~106.44%。-25℃冻存的电泳标准品可冻融3次使用,2~8℃可保存1周;加入等体积甘油后可以在-10~-20℃保存备用。结论 本方法具有良好的线性、准确度和精密度。用该方法进行C1-INH的抗原含量检测可作为纯化工艺内部质量控制指标,主要用于工艺摸索中低质量浓度C1-INH的抗原含量检测。

人C1酯酶抑制剂初步纯化过程pH值和聚乙二醇含量的优化

目的探讨pH值、聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)含量和离心条件对PEG4000粉末用于去除人C1酯酶抑制剂(C1 esterase inhibitor,C1-INH)制备原料中的IgM效果的影响,并通过对羧甲基(carboxymethyl,CM)离子交换层析中洗脱盐离子浓度的筛选,分离活性与非活性C1-INH。方法向不同pH值的C1-INH制备原料中加入不同质量分数的PEG4000,于不同条件下离心后,用特定蛋白检测仪对离心后上清液中IgM和C1-INH含量进行检测,确定PEG沉淀法纯化C1-INH的最佳条件。将离心后上清液调节pH后作为CM离子交换层析上样样品,使用不同盐离子浓度的洗脱液对活性C1-INH进行分离,确定最佳的盐离子浓度。结果在弱酸性pH(6.8)下,当PEG4000质量分数为12%,离心条件15000×g、25℃、20 min时,IgM去除率>99%,且C1-INH的回收率>80%;在盐离子浓度为200 mmol/L时,产物中C1-INH的比活性最大(4.43 IU/mg),且绝大多数杂质蛋白得以去除。结论优化条件下,PEG4000能有效去除C1-INH制备原料中的IgM,且能保持较高的C1-INH回收率;CM离子交换层析能对活性与非活性C1-INH进行有效分离,并去除大多数杂质蛋白。

新型冠状病毒中和抗体胶体金测试卡检测不同人群中和抗体的可行性分析

目的:比较2种不同原理制备的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)中和抗体胶体金测试卡与SARS-CoV-2假病毒中和实验的相关性,评估半定量的中和抗体胶体金测试卡用于不同人群的SARS-CoV-2中和抗体检测的可行性。方法:分别采用厂家A胶体金测试卡(双抗原夹心法)、厂家B胶体金测试卡(竞争阻断法)和SARS-CoV-2假病毒中和法进行检测,比较这2种胶体金方法与中和实验的相关性和敏感度;在确定了测试卡厂家后,检测新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疫情暴发前制备的静注人免疫球蛋白及特异性免疫球蛋白,考察其特异性;对ELISA高稀释倍数新冠疫苗免疫后血浆进行原倍和稀释品检测,判断是否有hook效应;检测不同ELISA稀释倍数档位的单份免疫后血浆,判断阳性率,观察色度变化;将ELISA低稀释倍数血浆按照比色卡筛选120NT_(50)和300NT_(50)这2个档位血浆,制备混浆,比较胶体金测试卡与ELISA和中和抗体的相关性。结果:厂家A和厂家B对英国国家生物制品标准化和质量控制研究所(NIBSC)第1代国际标准品20/136(抗SARS-CoV-2人免疫球蛋白国际标准品)的检测限分别为0.6125和5 IU·mL^(-1);对不同档位的混浆(新冠病毒疫苗免疫后血浆及COVID-19康复者恢复期血浆)的检测结果与中和抗体效价相关性好,检测ELISA高稀释倍数(10000以上)新冠病毒疫苗免疫后血浆未出现hook效应;不同ELISA稀释倍数的单份血浆的阳性率在稀释倍数160以上达到100%,但是色度深浅不一,在稀释倍数640以上色度均一性较高,且色度随着ELISA稀释倍数增高整体逐渐变深。按照比色卡色度筛选的Ppool 120NT_(50)和Ppool 300NT_(50)与中和抗体效价接近。结论:采用双抗原夹心法的厂家A中和抗体测试卡检测COVID-19康复者恢复期血浆和新冠病毒疫苗免疫后血浆的结果与假病毒中和实验效价的相关性优于采用竞争抑制法的厂家B产品及间接ELISA,且检测线的色度深浅与中和抗体水平正相关,可半定量检测用于不同人群的中和抗体筛查。

人血浆中纤维蛋白溶酶原纯化工艺样品蛋白含量改良BCA检测方法的建立及验证

目的建立检测人血浆中纤维蛋白溶酶原(plasminogen,Pg)改良PIerceTMBCA蛋白试剂盒方法(简称改良BCA法),并进行验证及初步应用。方法结合PierceTMBCA试剂盒的试管法与微孔板法检测人血浆中Pg;比较标准曲线拟合方式确定改良试剂盒的线性范围;通过牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)国家标准品和PIerceTM BCA试剂盒附带的BSA标准品互相标定确定内控标准品;通过平行性试验分析BSA作为标准品检测Pg蛋白含量的可行性。验证方法的准确性、精密性及选择性。应用改良的BCA法检测Pg纯化过程的蛋白含量,并与凯氏定氮法和双缩脲法进行比较,同时检测201903003批Pg工艺纯化过程样品蛋白含量的相对纯度及比活性变化。结果改良BCA法选择二次函数拟合,PIerceTMBCA试验盒线性范围为62.5~2000μg/mL,试剂盒附带的BSA标准品(2000μg/mL)用BSA国家标准品标定结果为2090μg/mL,可作为内控标准品使用;Pg所在工艺组分浓度在250~2000μg/mL时,内控BSA曲线与Pg曲线的平行性最好。内控标准品的高(1500μg/mL)、中(750μg/mL)、低(150μg/mL)、检测下限(62.5μg/mL)及BSA国家标准品(2000μg/mL)的回收率在88.61%~103.78%之间,批内及批间CV均<10%;Pg工艺缓冲液中150 mmoL/L辛酸钠、25 g/L蔗糖、5 g/L甘氨酸、3%盐酸精氨酸对检测无影响,1%溶剂/去污剂(S/D)稀释至少40倍对检测无干扰。改良BCA法检测Pg纯化工艺的原液、半成品结果与双缩脲法和凯氏定氮法的符合性良好。201903003批工艺样品从原料血浆经过3步纯化后获得Pg半成品,其比活性从0.02 U/mg升至8.42 U/mg,相对纯度从0.19%升至81.94%。结论成功建立了改良的BCA蛋白定量检测方法,该方法线性范围广,平行性、准确性、精密性及选择性良好,既可用于Pg纯化工艺中间品的质量监控,也可用于原液、半成品的蛋白含量检测。