无籽刺梨及其近缘种叶绿体基因组序列比较分析

【目的】探讨无籽刺梨及其近缘种之间的系统发育关系,为蔷薇属植物后期分子鉴定和群体遗传研究奠定基础。【方法】从NCBI数据库下载了6种植物的叶绿体基因组序列,包括无籽刺梨和其近缘种。利用生物信息学方法对这些基因组序列进行了研究,包括基因组结构、重复序列、高变区序列以及基于叶绿体全基因组序列的系统发育关系。【结果】6种植物的叶绿体基因组呈环状四分体结构,其长度为156561~156749 bp,平均GC含量均为37.2%,且6种植物基因组的反向重复(inverted repeat,IR)区未表现出明显的扩张和收缩。在对蔷薇属植物叶绿体基因组序列进行比较分析时,筛选出了7个高变区序列,包括trnK-trnQ、psbM-trnY、ycf3-rps4、rps4-trnL、psbE-petG、rpl16 intron和ycf1。这些序列可作为候选标记,用于进一步研究蔷薇属植物的系统发育。同时,利用叶绿体全基因组序列重建了蔷薇属植物的系统发育树。结果表明,无籽刺梨和刺梨是独立的2个种类,其中无籽刺梨与贵州缫丝花有较近的亲缘关系,而刺梨与单瓣缫丝花有较近的亲缘关系。【结论】无籽刺梨及其近缘种之间叶绿体基因组结构高度相似,单拷贝区核苷酸多样性高于重复区。

滇杨组织培养再生及遗传转化体系建立

【目的】建立高效的滇杨Populus yunnanensis离体叶片再生及遗传转化体系,有助于滇杨基因工程育种研究。【方法】以滇杨叶片为外植体,研究不同植物生长调节剂组合对叶片愈伤组织和不定芽诱导及生根的影响,从而获得滇杨再生组培苗;进一步以农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导法探讨菌液吸光度、侵染时间和共培养时间等对滇杨遗传转化效率的影响。【结果】滇杨愈伤组织诱导的最适培养基为1/2 MS+0.005 mg·L^(−1)噻苯隆(TDZ)+0.010 mg·L^(−1)萘乙酸(NAA),诱导率达91.7%;不定芽诱导的最佳培养基为1/2 MS+0.002 mg·L^(−1) TDZ+0.010 mg·L^(−1) NAA,诱导率为75.0%;生根最适培养基为1/2 MS+0.010 mg·L^(−1) NAA+0.100 mg·L^(−1)吲哚乙酸(IBA),生根率高达96.7%,平均生根数为2.57条。利用pBI121-GUS载体转化滇杨,最适转化菌液吸光度D(600)为0.2,侵染时间为5 min,共培养时间为2 d;在分化过程中,抑制农杆菌生长的头孢霉素(Cef)最佳质量浓度为200 mg·L^(−1),抗性筛选中最佳培养基的卡那霉素(Kan)质量浓度为20 mg·L^(−1)。对再生植株进行β-D-葡萄糖苷酸酶(GUS)组织化学染色和PCR鉴定,获得20株阳性植株,转化阳性率为45.45%。【结论】本研究成功建立了滇杨离体叶片再生和遗传转化体系。

不同干形云南松的木材解剖特征及其化学成分分析

【目的】探究直干和扭曲干云南松的木材解剖特征及其化学成分差异,为后续从分子水平解析云南松干形变异机制奠定基础。【方法】以直干和扭曲干云南松树干木质部为材料,利用生物显微镜和荧光显微镜对其解剖结构进行观察和研究,利用比色法结合傅里叶红外光谱对其主要化学成分进行分析。【结果】扭曲干云南松木材属于应压木,其应压木(twisted compression wood,TCW)细胞在横切面上具有缺口、内卷、变圆、细胞间隙增多且变大的特征,在径切面上具有螺纹裂隙管腔,在弦切面上创伤树脂道明显增多;扭曲干云南松对应木(twisted opposite wood,TOW)和直干云南松木质部(S)的解剖特征无明显差别。与TOW和S相比,TCW的管胞长度变短,宽度变窄,腔径变小,早材细胞壁增厚,木质素含量显著增加,纤维素含量显著降低,且木质素在次生壁S2层外层和细胞角隅积累,而TOW和S的木质素均匀分布在细胞角隅和胞间层。【结论】直干和扭曲干云南松的木材解剖特征有明显差异,且两者的纤维素、半纤维素和木质素的含量与分布也有显著差异。

一株产吲哚乙酸的日本野漆树内生枯草芽孢杆菌生长条件及其促生特性研究

【目的】从日本野漆树(Toxicodendron succedaneum)组培苗分离和筛选了1株产吲哚乙酸(indole-3-acetic acid,IAA)的内生细菌(BSH-1),对其进行鉴定并分析其促生特性,为开发微生物肥料提供理论依据。【方法】通过革兰氏染色法观察菌株BSH-1的形态,结合16S rRNA基因序列分析和系统发育分析确定其分类学地位;利用生长曲线法测试菌株BSH-1的适宜生长温度、pH值和NaCl质量浓度;利用Salkowski显色法测定菌株产生IAA的能力;采用不同密度的菌株发酵液分别浸泡水稻、云南松和思茅松种子,通过统计种子萌发率以及水稻幼苗的株高、茎粗、生根数和根长等指标分析菌株的促生特性。【结果】鉴定菌株BSH-1为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),该菌在35℃、pH值为7和10 g/L NaCl条件下生长量最大。菌株BSH-1产IAA的能力达到17.27 mg/L;可通过促进水稻幼苗的株高、茎粗和生根数促进植株生长,其中株高和生根数分别比对照高9.0%和20.8%。【结论】枯草芽孢杆菌BSH-1能产生IAA,促进水稻幼苗生长,具有生物菌肥开发潜力。

滇杨优树遗传多样性的AFLP分析

以收集于云南和四川的52株滇杨优树为试验材料,并以1株大叶杨、1株北京杨和2株黑杨做类外对照,采用AFLP分子标记技术进行基因组DNA水平检测。结果表明,筛选出的8对EcoRⅠ+3/MseⅠ+3引物组合对52株滇杨优树共扩增出264条带,其中多态性条带174条,多态带百分率为64.52%,检测到有效等位基因数(Ne)为1.184,基因多样度(H)为0.121,Shannon信息指数为0.201,平均遗传相似系数为0.877;对56份杨树样本共扩增出325条带,其中多态性条带共247条,多态带百分率为75.21%,检测出有效等位基因数(Ne)为1.185,基因多样度(H)为0.122,Shannon信息指数为0.209,平均遗传相似系数为0.876。UPGMA聚类分析结果显示,除滇杨优树QXB007与QXJ030外,其余杨树分析样本均能够被鉴别。基于采集地和遗传相似系数的模糊聚类分析表明,52株滇杨优树除开远采集地外,丽江采集地样本与其他采集地样本之间均有交集,说明丽江可能是滇杨的分布中心和起源中心。该研究结果为滇杨人工选择育种、遗传改良、种质资源收集与保存等提供了理论依据。

西南地区古杨树遗传多样性的SSR分析

采用SSR分子标记技术,对采集于中国西南地区的7种15个群体共226株杨树古树的遗传多样性进行分析,以揭示杨树古树的遗传变异水平及其遗传关系,为该区域杨树古树资源的合理保护与利用提供依据。结果显示:(1)7对SSR引物组合共扩增出80个多态性位点;以有效等位基因数为标准,7种杨树之间的遗传多样性水平依次为:西南杨>昌都杨>康定杨>藏川杨>乡城杨>川杨>德钦杨;杨树种内群体间的遗传多样性依次表现为:乡城杨的稻城群体>乡城群体>雅江群体,西南杨的理塘群体>乡城群体>稻城群体,德钦杨的香格里拉群体>德钦群体,昌都杨的芒康群体>贡觉群体>昌都群体,藏川杨的德钦群体>芒康群体。(2)乡城杨和西南杨群体内近交系数(F_(is))分别为-0.024 6和-0.253 5,藏川杨、德钦杨和昌都杨的Fis分别为0.205 4、0.240 1和0.029 2;乡城杨、西南杨、藏川杨、德钦杨和昌都杨群体间的遗传分化系数(F_(st))分别为0.156 1、0.253 5、0.128 8、0.182 0和0.177 3;除西南杨群体间基因流N_m小于1外,乡城杨、藏川杨、德钦杨和昌都杨群体间的基因流N_m均大于1。(3)7种杨树古树的遗传相似系数介于0.089 0~0.691 0,平均为0.402 0;UPGMA及Bayesian聚类结果均显示,7个树种可以分为3个大组,即川杨与康定杨聚为一组,乡城杨与西南杨聚为一组,藏川杨、德钦杨和昌都杨聚为第3组;5种杨树古树的群体UPGMA聚类结果显示,除西南杨的理塘群体与乡城杨聚为一组外,各杨树古树种与群体间的聚类关系较为紧密。研究表明,西南地区杨树古树具有较为丰富的遗传多样性,且其遗传变异主要均存在于群体内不同个体之间,任何个体的丧失均会导致杨树古树遗传多样性的降低或丧失,故需要加强对该区域现存古树资源的保护。

马缨杜鹃不同完整性居群遗传多样性的AFLP分析

采用选择性扩增片段多态性（AFLP）技术对马缨杜鹃5个不同完整性居群的遗传多样性进行检测和分析。结果表明：筛选出的7对引物组合共扩增出527条带，其中多态带382条，多态带百分率为72.49%；5个居群间的多态性百分率在52.23%～69.64%之间，居群平均多态性百分率为57.80%；Nei’s基因多样性变化范围在0.1139～0.1738之间，Shannon信息指数为0.1868～0.2777；居群间遗传分化系数Gst为0.1688，表明83.12%遗传变异发生在居群内，居群间基因流为2.4624，足以维持居群间现有的遗传结构；AMOVA分析结果表明，18.34%的遗传变异存在于居群间，81.66%的遗传变异存在于居群内；基于UPGMA聚类结果，可将5个马缨杜鹃居群分为3组，紫溪山和板凳山居群、马雄山和小营地居群之间各为一组，老湾地居群独自一组。研究表明，该物种有些居群虽遭受严重的人为破坏，但居群的遗传多样性仍然较高。

西南地区9种乡土杨树的秋季光合特性比较

季节是影响植物光合特性的重要因素之一,而树木秋季光合作用为次年生长储备营养物质,也是林木育种的重要指标。为了解西南地区9种乡土杨树在秋季生长期对光能的利用效率,以收集于西南地区不同海拔的滇杨、大叶杨、藏川杨、德钦杨、昌都杨、康定杨、乡城杨、西南杨和三脉青杨为研究对象,在10月初采用LI-6400便携式光合测定仪对其光合参数进行测定。结果表明:1)滇杨和藏川杨的生长量优于其他树种。2)乡城杨净光合速率(P_(n))日变化呈现为不对称的双峰曲线,其他8种杨树均为单峰曲线,但峰值出现的时间不同;而9种杨树的蒸腾速率(T_(r))日变化均为单峰曲线,大叶杨T_(r)峰值出现在12:00,其他8种杨树均在14:00;9种杨树的气孔导度(G_(s))、胞间CO_(2)浓度(C_(i))和水分利用率(WUE)日均值均存在极显著差异,昌都杨G_(s)日均值最大(0.37 mmol·m^(-2)·s^(-1)),康定杨C_(i)日均值最小(284.2224μmol·mol^(-1)),且水分利用率(WUE)最高(4.9966μmol·mmol^(-1))。3)综合4个光合参数,西南杨和康定杨具有较大的后续生长潜力,且康定杨耐旱性较强,而昌都杨和大叶杨耐旱能力较弱。因此,在今后推广应用及经营管理中,需要考虑不同树种对水分需求的差异。

滇杨侧芽不同季节内源激素含量变化动态

植物内源激素在植物体内含量甚微，也往往不是由一个器官产生，却通过极性和非极性运输到达一定的部位而产生重要的作用[1]，它们参与各细胞、组织和器官之间的信息交流，从而维持植物正常的生长发育过程[2]。高等植物通过顶端分生组织和侧生分生组织的活性来建立地上株型系统，而植物激素作为整合调控分生组织信号的使者，与植物株型的形成密切相关[3]。

西南地区乡土杨树遗传变异的SRAP分析

采用SRAP分子标记技术对西南地区11种乡土杨树共333份样本的遗传变异进行分析,7对引物组合共扩增出215条带,其中多态性条带158条,多态性条带百分率为73.49%,表明11种乡土杨树间存在广泛变异。AMOVA分析结果显示,种间遗传变异分量为10.84,占总变异的48.70%,遗传差异达极显著水平（P〈0.001）。种间的遗传相似系数变幅在0.8199~0.9607之间,平均遗传相似系数为0.8983。聚类结果表明,昌都杨和藏川杨之间的遗传差异最小,大叶杨和三脉青杨之间的遗传差异最大。本研究结果为西南地区乡土杨树基因资源的保护、开发和利用提供了一定的科学理论依据。

地理隔离对西南藏区山杨居群遗传结构影响的SRAP分析

采用SRAP分子标记技术,对分布于我国西南3个藏族地区山杨9个居群130个个体进行了遗传结构分析。结果表明,筛选出的7对引物组合共检测到多态性条带(AP)99条,多态性条带百分比(PPB)为59.28%。采用POPGENE软件分析,山杨9个居群平均多态位点百分率(PPB)为33.80%,Nei’s基因多样性指数(H)和Shannon’s信息指数(I)分别为0.130 9和0.213 7,较东北地区山杨具有偏低的遗传多样性。遗传分化系数Gst=0.325 5,表明遗传变异主要存在于居群内个体间。地理距离与遗传距离之间具有弱相关关系(r=0.349,P=94.5%),山脉阻隔效应是导致西南藏族地区山杨居群间遗传分化的主要因素。UPGMA聚类表明,甘孜地区4个居群与迪庆地区的维西居群具有较近的亲缘关系,迪庆地区的德钦、香格里拉居群和昌都地区2个居群的遗传相似度较高。基于西南藏族地区山杨遗传结构分析,建议实施就地保护的同时,建立山杨种质资源库,促进不同居群间的基因交流。

基于cpDNA和rDNA ITS片段分析西南地区青杨派杨树的系统发育与进化关系

西南地区青杨派杨树种质资源丰富,可为杨树遗传改良提供珍贵的基因资源,但树种之间形态学差异细微,该研究以山杨作为外类群,测定了西南地区及其他地区杨属青杨派17个种（杂种）共36份样本的3个叶绿体片段（atpF-atpH、trnL-F和matK）和核糖体ITS片段,并对其进行系统发育分析,以探讨西南地区青杨派树种的系统进化关系。结果表明：（1）在所有样本中,3个叶绿体片段atpF-atpH、trnL-F、matK的长度分别为605~634bp、957~1 010bp、819bp,3个片段拼接后的联合序列包含29个变异位点和15个信息位点;ITS片段对齐后的长度为646bp,变异位点19个,信息位点17个。（2）基于叶绿体联合序列和ITS片段的杨属青杨派树种的平均遗传距离分别为0.001 3和0.003 6。叶绿体联合片段的MP和Bayes系统树树型基本一致,青杨派树种可以划分为2组,第1组由青杨、三脉青杨、大青杨和辽杨构成;第2组中的小叶杨、小青杨、川杨、德钦杨、昌都杨、乡城杨、康定杨、西南杨、滇杨和藏川杨不能有效区分,且均与缘毛杨的遗传关系较近。（3）基于ITS的系统树与叶绿体联合片段构建的系统树差异不大,仅在于第2组中的小青杨与小叶杨、川杨等差异明显,与第1组中的树种紧密聚拢。

基于SRAP标记的不同干形云南松遗传基础研究

采用SRAP分子标记对6个居群不同干形云南松180份样品进行全基因组扫描,并对不同干形特有差异条带进行克隆及测序比对,预测调控干形变异的候选基因。结果显示:14对引物共扩增出584条带,多态带551条,多态带百分率为94.35%,平均每对引物扩增出41.7条带和39.4条多态带。6个居群云南松的有效等位基因数(Ne)为1.4516~1.4872,Nei's基因多样性指数(H)范围为0.2703~0.2904;2种干形云南松的有效等位基因数(Ne)介于1.3655~1.4541之间,Nei's基因多样性指数(H)变幅为0.2181~0.2687。居群间的遗传分化系数(Gst)和基因流(Nm)分别为0.1573和2.6787,干形间的遗传分化系数(Gst)和基因流(Nm)分别为0.0087和56.7002,表明居群间、不同干形云南松间的基因交流频繁,遗传分化较小。对26条不同干形云南松之间的特有差异条带序列分析表明,过氧化氢酶(kat A基因)、核酸内切酶、糖基水解酶和AN1锌指蛋白(SAP6)等可能参与了云南松干形发育的调控。

果树果实保鲜力强弱标记基因ACO

果树果实的成熟期与保鲜是影响其经济价值的重要因素,ACC氧化酶是植物乙烯合成途径中的重要酶,催化ACC合成乙烯,进而催化果实的成熟。研究ACC氧化酶基因(ACO)对标记和提高果实的保鲜力具有重要意义。本研究对中华猕猴桃(Actinidia chinensis)、美味猕猴桃(Actinidia deliciosa)、杏(Prunus armeniaca)、葡萄(Vitis vinifera)、苹果(Malus domestica)、西洋梨(Pyrus communis)、沙梨(Pyrus pyrifolia)、桃(Prunus persica)、梅(Prunus mume)、大蕉(Musa ABB)10种果树的ACO基因进行氨基酸序列、蛋白质理化性质及结构、系统发育等生物信息学进行分析,并对这10种果树进行聚类。结果表明:(1)苹果较梅更耐储藏,桃与杏保鲜能力相当,西洋梨和沙梨保鲜力相当,中华猕猴桃和美味猕猴桃保鲜力相当;(2)ACO基因可用于同科物种间保鲜能力的选择,这可能与ACO基因编码氨基酸序列18位点处变异、2OG-Fe II Oxy基因家族的高度保守和ACO的多元作用机制有关;(3)ACO的作用机制为在游离核糖体上合成稳定的亲水性蛋白质后,不经蛋白转运,直接在细胞膜内表面氧化ACC合成乙烯,受基因型和外界刺激的多重影响。因此,果树ACO基因可用于属间物种间果实保鲜能力的选择,是一个重要的功能基因。

不同处理措施对滇杨根萌苗形成与生长的影响

为建立高效稳定的滇杨返幼复壮根萌苗培育技术体系,以滇杨根段为材料,研究种根长度、切口涂封方式和埋根方式对根萌苗形成及其生长的影响。结果表明:种根长度对根萌苗数量和种根生根数量影响极显著,根萌苗数量和种根生根数量随种根长度的增加而增加,苗高和苗粗随种根长度的增加而降低;切口涂封方式对苗高和苗粗生长有极显著影响,以两端均不涂封的效果最佳;埋根方式对根萌苗数量、种根生根数量、苗高和苗粗的影响均不显著,但斜埋对根萌苗数量、苗高和苗粗的作用效果略优于平埋。

澳洲坚果不同外植体愈伤组织诱导与不定芽增殖研究

以澳洲坚果品种‘H2’的幼嫩茎段和种子为材料,获取腋芽、子叶和上胚轴等外植体,开展愈伤组织诱导及不定芽增殖研究,再通过石蜡切片法对不同愈伤组织的细胞结构进行观察,分析比较不同外植体诱导的愈伤组织性质与不定芽分化效果。结果表明:适合腋芽愈伤诱导和分化的培养基为MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT,腋芽愈伤量大,不定芽增殖系数为3.49;适合子叶愈伤诱导的培养基为MS+2.0 mg/L TDZ+200 mg/L CH,愈伤组织多为绿色且质地紧密,诱导率高达82.2%,褐化率低至8.9%;适合子叶愈伤组织分化不定芽的培养基为MS+1.0 mg/L KT+0.2 mg/L NAA+1.0 mg/L GA3,不定芽长势较好,增殖系数为5.40;上胚轴几乎不产生愈伤组织,可直接分化不定芽;适合上胚轴分化不定芽的培养基为MS+1.0 mg/L KT+0.5 mg/L NAA,增殖系数为7.37。细胞学观察发现,腋芽愈伤组织的细胞体积较大、液泡化程度较高、细胞质较少、细胞核较小,且细胞间排列分散且不规则,显示出非胚性愈伤组织特征;子叶愈伤细胞排列较紧密、细胞核较大、细胞质较厚且被染色深,显示出分生组织细胞的特征。比较而言,子叶是诱导愈伤组织的优良材料,上胚轴是不定芽增殖的最佳外植体。

滇杨侧芽休眠期基因表达多样性的cDNA-AFLP分析

为探讨滇杨分枝特性差异的分子机理,对采集于四川省和云南省的59个滇杨优树无性系3a生苗木进行了cDNA-AFLP差异研究,分析了苗木侧芽休眠时基因表达的多样性。结果表明:筛选出的7对引物组合共扩增出了总条带608条,其中有353条差异性条带,Nei’s基因多样性指数为0.1061,Shannon信息指数为0.1856,遗传分化系数为0.0123,居群间的基因流为40.28,表明居群间的遗传分化程度较低。分子生物学方差分析(AMOVA)结果表明,居群间的差异仅为0.99%,差异不显著(P=0.052),居群内差异占99.01%,差异极显著;表明滇杨侧芽在休眠期个体之间基因表达的复杂性;聚类分析结果显示,在亚分枝单元或最小分枝单元,大部分无性系能够以分枝性状相聚。该研究结果为进一步开展滇杨分枝相关基因的筛选及克隆等工作奠定了前期研究基础。

滇杨遗传多样性的SRAP分析

采用SRAP标记分析滇杨的遗传多样性和遗传结构。用筛选出的7对引物组合分析来自7个居群共208个样本,共扩增得到条带146条,多态性条带73条,多态带百分率为50%。滇杨物种水平上的观测等位基因数(Na)为1.500 0,有效等位基因数(Ne)为1.230 9,Nei’s基因多样性指数(H)与Shannon’s信息指数(I)分别为0.136 6与0.210 0。遗传分化系数(Gst)为0.529 4,基因流(Nm)为0.444 4,表明居群间的遗传变异大于居群内,其基因交流处于中等水平。AMOVA分析也表明居群间的变异占总变异的55.61%。UPGMA、PCo A和Bayesian聚类分析结果一致,均显示丽江与曲靖居群、楚雄与昭通居群的亲缘关系较近。Mantel test结果表明滇杨居群间的遗传距离与地理距离不相关。

AFLP引物组合数对准确分析马缨杜鹃遗传多样性的影响

利用5、7、9、11和13对AFLP引物组合对4个居群马缨杜鹃遗传多样性进行分析,探讨不同引物组合数量对其遗传多样性参数指标的影响。结果表明:随着引物组合数量的增加,紫溪山居群遗传多样性的各参数指标变化趋势一致,5对引物组合检测结果略高于其他引物组合数,但差异不显著,其余3个居群的变化规律不明显;不同引物组合数量对居群间遗传距离无显著影响,UPGMA聚类结果完全相同。由此可见,选用5对引物组合对马缨杜鹃进行遗传多样性分析就能够提供较为准确的结果。

滇杨与毛白杨插穗内源激素含量的比较研究

【目的】对滇杨和毛白杨插穗基部皮层内源激素测定,探讨插穗生根过程中内源激素对不定根形成的影响。【方法】以易生根的滇杨和难生根的毛白杨为试材进行扦插繁殖,采用高效液相色谱法(HPLC)检测2种杨树插穗基部(土面以下)皮层内源生长素(IAA)、脱落酸(ABA)、赤霉素(GA3)和玉米素(ZT)含量的动态变化。【结果】滇杨插穗7 d时产生愈伤组织,21 d时不定根形成,毛白杨21 d出现愈伤组织,直至49 d都无不定根形成。滇杨插穗基部皮层内IAA和ZT含量均略高于毛白杨,但差异均不显著(P>0.05);毛白杨插穗基部皮层于整个观测期内有高浓度的ABA和GA3富集,且与滇杨插穗基部皮层的含量差异均达极显著水平(P<0.01)。【结论】IAA或ZT并不是影响毛白杨扦插难生根的主要因素,而高含量的ABA和GA3可能抑制了其插穗不定根的形成。