新型猪伪狂犬病流行情况及净化措施

2011年11月份我国发生新型猪伪狂犬病疫情,导致中大猪、母猪出现典型的伪狂犬症状而死亡。目前,各地分离到的猪伪狂犬病毒（PRV）流行毒株基因组同源性非常接近。通过PCR检测新分离的伪狂犬病毒,测序后发现毒株出现基因变异,与Bartha株比较,其毒力相关基因RR基因第31-36位出现6个连续碱基的缺失,免疫原g B基因的第224~232位发生9个碱基GCCCCGGCC的缺失。毒力基因的变化导致PRV毒株的毒力明显增强。针对我国新型猪伪狂犬病的流行情况、发生原因以及该病对我国养猪业造成的危害进行了分析讨论,对新型伪狂犬病的毒株变异现象、临床新表现、病理新变化以及诊断方法作了阐述,并提出了新型伪狂犬病的防制和净化措施。

鉴别猪伪狂犬病病毒的双重PCR方法的建立及初步应用

为了检测猪伪狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV）的感染情况,并进行强弱毒株的鉴别诊断,本研究建立了快速、简便、灵敏度高、特异性强的鉴别猪PRV的双重PCR方法.针对PRV gE和gB基因序列,分别设计了2对特异性引物,通过对退火温度（50～60℃,按照1℃递增）、引物浓度（0.2～1.4 μL,依次增加0.2μL）的优化,结果表明,双重PCR反应的最佳退火温度为56℃、最适引物添加量为1 μL.特异性试验结果表明,该方法可以扩增出PRV gE（316 bp）和gB（432 bp）的目的片段,对PCV2、PTV、CSFV、PPV、PRRSV、大肠杆菌的DNA或eDNA均无扩增.敏感性试验结果表明,PRV gE和gB的最低核酸检出量分别为4.4×103和3.3×103拷贝/μL,与单一PCR方法的敏感性相近.应用该方法对广东、广西地区临床送检的56份组织样品进行检测,检测结果显示,强毒感染阳性率为53.6％（30/56）,阴性率为46.4％（26/56）,未发现有弱毒感染.

两广部分地区仔猪腹泻死亡的流行病学调查

研究旨在分析广东、广西地区2015年1—10月份腹泻仔猪群中猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)发病情况和流行特征,以便为今后的防控提供理论数据。分别采用RT-PCR检测PEDV、用Nano PCR方法检测PRV,对2015年1—10月份广东、广西地区7个地市临床送检的56份组织样品(包括心、肝、脾、肺、肾、淋巴等,其中有35份含有小肠样品)进行病原核酸检测。病原核酸检测结果显示:PEDV的阳性率为14.28%,PRV的阳性率为53.6%;PEDV与PRV混合感染率为8.57%。对PEDV阳性样品的S1基因进行遗传进化分析,结果显示,研究获得PEDV阳性样品的S1基因与2015年广东分离的CH-HGC-01-2015的亲缘关系较近。由此可见,广东、广西地区PRV发病率较高,PEDV的发展呈新的流行态势,并且存在PEDV和PRV的混合感染。

一株猪伪狂犬病病毒变异株的分离鉴定

为了解广东省猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)野毒株的基因变异及遗传演化的情况,本试验对广东佛山疑似暴发伪狂犬病的猪场采集的病料(脑、肺脏、扁桃体、肝脏、脾脏)进行了PCR鉴定,初步鉴定为PRV毒株后,将阳性病料接种非洲绿猴肾细胞(Vero),进行毒株传代培养,对分离毒株进行PCR检测及小鼠感染试验,证实该病毒为PRV,并命名为PRV FS-2015株;并对该毒株进行细胞病变观察、病毒TCID50测定、毒株gC和TK基因扩增及序列分析。结果显示,PRV FS-2015株TCID50为10-7.5/0.1mL。PRV FS-2015株的gC和TK基因序列与国内外PRV参考毒株进行同源性比对分析发现,其核苷酸序列同源性分别为95.8%~100.0%和99.4%~100.0%,氨基酸同源性分别为92.3%~100.0%和98.7%~100.0%。遗传进化分析表明,PRV FS-2015株与国内近几年分离的PRV变异株GY、ZJ01、HB1201、HN1201、JS2012、BJ/YT和BP属于同一分支,同源性较高,亲缘关系更近;但与PRV经典株Kaplan、Becker、NIA3、Kolchis、Bartha、Yangsan、Min-A、SS和SL株的同源性较低,基因变异较大,表明PRV FS-2015毒株属于近几年流行的变异株。本研究结果可为广东省伪狂犬病的防控工作和疫苗株的选择提供科学依据。

伪狂犬病病毒FS-2015株gE和gB基因序列分析

为了解猪伪狂犬病病毒(porcine pesudorabies virus,PRV)gB和gE基因变异及遗传演化情况,本研究针对PRV FS-2015野毒株,应用"蚀斑法"对组织病料中病毒进行三轮纯化,应用全长扩增引物对FS-2015株gB和gE基因进行全基因扩增,并对PCR产物进行测序和序列分析。结果显示,PRV FS-2015株的gB、gE基因与国内外PRV参考毒株的核苷酸同源性分别为97.0%～100.0%和97.5%～99.7%,氨基酸同源性分别为96.4%～100.0%和95.3%～99.7%。氨基酸变异位点分析表明,FS-2015株的gB和gE基因均有位点突变和缺失。遗传进化分析表明,FS-2015株与国内近几年分离的PRV变异株GY、ZJ01、HB1201、HN1201、JS2012、BJ-YT和BP属于同一分支,同源性较高,亲缘关系较近;与PRV经典株Kaplan、Becker、NIA3、Kolchis、Bartha和Yangsan株属于不同分支,同源性较低,亲缘关系较远。从PRV FS-2015毒株与国内外经典毒株和当前国内流行的变异毒株的分析结果可知,PRV FS-2015毒株发生了一定的变异,属于当前国内流行变异毒株。本研究结果为广东省伪狂犬病分子流行病学调查、伪狂犬病的防控和疫苗株挑选工作提供参考数据。