T细胞受体工程化T细胞的流式检测方法的建立

[目的]建立特异性识别乙肝病毒表面抗原的T细胞受体工程化T细胞(T cell receptor-engineered T cells, TCR-T)的流式检测方法。[方法]将3个检测抗体分别进行梯度稀释(死细胞指示剂FVS780:0.020~10.000μg/mL、鼠抗人的CD3抗体:0.039~20.000μg/mL和结合TCR的多肽-MHC复合物蛋白Dextramer-PE:1∶5至1∶2 560倍稀释)后,分别与同一TCR-T细胞共孵育,得出最佳使用浓度。两个不同分析人员采用此方法分别同时对3批TCR-T细胞样本进行3次检测,计算TCR阳性T细胞比例的CV值考察方法的中间精密度。同一分析人员分别检测2批TCR-T细胞的6个平行样本,计算TCR阳性T细胞比例的CV值考察方法的重复性。经组合染色后的TCR-T细胞采用荧光减一对照细胞样本进行梯度稀释得到12个不同TCR阳性T细胞比例的样本,检测后分析结果得到检测限和定量限。对同一工艺生产的3批TCR-T细胞的检测结果进行统计学分析。[结果]确定最佳抗体使用浓度分别为:FVS780:0.313μg/mL,CD3抗体:2.500μg/mL,PE-Dextramer:1∶20稀释。中间精密度考察3批TCR-T细胞检测结果的CV分别为3.2%、7.4%和2.2%。重复性考察2批TCR-T细胞检测结果的CV分别为2.1%、2.2%。3批产品批内差异统计的P值分别为0.706、0.706和0.09,均>0.05;批间差异统计的P值为0.171,>0.05。[结论]建立了特异性、精密度(CV<10%)和灵敏度(定量限为0.85%,检测限为0.45%)均良好的识别乙肝病毒表面抗原的T细胞受体工程化T细胞的流式检测方法。