依赖Ca^(2+)的ATP过量释放在机械牵张所致气道上皮黏蛋白5AC高分泌中的作用

目的探讨人气道上皮细胞三磷酸腺苷(ATP)释放量的改变在机械通气所致气道黏液高分泌中的作用。方法人气道黏膜上皮细胞(HBE16)体外培养,通过节律性倾斜细胞培养板,利用液体的表面张力、大气压及液体重力所产生的牵张力(剪应力)及压力(压应力)给予压力牵张刺激,并利用向密闭盒中注入医用氧气增加压力以模拟机械通气,各组培养细胞依施加条件不同而分为对照组、单纯倾斜组、倾斜+钙离子螯合剂BAPTA-AM、倾斜+BAPTA-AM+钙离子螯合剂EGTA、加压+倾斜、加压+倾斜+嘌呤P2Y受体阻断剂reactive blue-2(RB-2)、加压+倾斜+BAPTA-AM、加压+倾斜+BAPTA-AM+EGTA,共8组,分别采用四甲基偶氮唑盐法(MTT)测定细胞活性、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组黏蛋白(MUC)5AC mRNA表达水平、ELISA法检测细胞培养上清液中MUC5AC含量、高效液相色谱法(HPLC)检测培养液中ATP释放量。结果加压+倾斜组细胞MUC5AC mRNA相对含量、培养上清液中ATP释放量和MUC5AC蛋白分泌量分别为:(11.80±0.01)、(7.41±0.45)μmol/g、(0.77±0.26),显著高于单纯倾斜组的(6.60±0.01)、(2.76±0.47)μmol/g、(0.25±0.01)及对照组的(3.40±0.01)、(0.00±0.01)μmol/g、(0.02±0.01)(均P<0.05)。RB-2、EGTA+BAPTA-AM处理后的加压+倾斜组细胞的MUC5AC mRNA相对含量分别为:(10.5±0.03)、(11.9±0.11),与加压+倾斜组相比抑制作用不显著(P>0.05);培养上清液中ATP释放量分别为:(0.05±0.02)μmol/g、(0.08±0.02)μmol/g,较加压+倾斜组显著降低(均P<0.05)。结论机械通气可以显著提高气道黏膜上皮MUC5AC的分泌,其机制与气道上皮细胞依赖Ca2+的ATP的过量释放密切相关。

张力敏感性阳离子通道在机械牵张引起气道黏液高分泌中的作用

目的观察张力敏感性阳离子通道、Ca^2＋内流和豆蔻酰化富丙氨酸C激酶底物（MARCKS）在机械牵张引起气道黏液高分泌中的作用。方法人气道黏膜上皮细胞（HBE16）体外培养，采用小型生物撞击机给予机械牵张刺激，各组培养细胞依施加条件不同而分为对照、牵张、牵张＋钆、牵张＋硝苯吡啶、牵张＋低分子量肝素、牵张＋MARCKS效应结构域（ED）锁核酸（LNA）以及牵张＋MARCKS的ED无关对照LNA序列共7组，分别采用逆转录聚合酶链反应（RT—Pert）和免疫荧光法观察与胞吐相关的突触相关膜蛋白SNAP23以及黏蛋白（MUC）5ACmRNA和蛋白表达，酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测细胞培养上清中MUC5AC分泌。结果机械牵张能显著升高人气道黏膜上皮细胞中SNAP23和MUC5AC表达，显著提升细胞培养上清中MUC5AC分泌（P〈0．05）；钆、硝苯吡啶、MARCKS的ED—LNA均能抑制机械牵张对SNAP23表达和MUC5AC表达、分泌的提升作用（均P〈0．05）；而低分子量肝素未能显著降低SNAP23表达和MUC5AC表达、分泌（P〉0．05）。结论机械牵张能升高人气道黏膜上皮细胞MUC5AC的表达，其机制可能与张力敏感性阳离子通道、Ca^2＋内流和MARCKS途径有关。

阿奇霉素通过基质金属蛋白酶9抑制气道黏液高分泌的实验研究．

目的探讨阿奇霉素（AZT）通过基质金属蛋白酶9（MMP9）抑制气道黏液高分泌的作用机制。方法培养人支气管上皮细胞株HBE16细胞，以中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）为刺激物。AZT和表皮生长因子受体（EGFR）拮抗剂BIBX1522为干扰因素，分别对NE刺激的HBE16细胞进行预处理。培养细胞分为对照组、NE组、AZT＋NE组和BIBX1522＋NE组。用RT-PCR检测各组细胞黏蛋白（MUC）5ACmRNA和MMP9mRNA；ELISA检测培养上清液中MUC5AC蛋白含量；明胶酶谱法测定培养细胞内MMP9活性；Western印迹检测细胞中MMP9、前酶原MMP9（pro—MMP9）和金属蛋白酶类组织抑制剂（TIMP-1）蛋白含量及磷酸化的EGFR（p-EGFR）和磷酸化的信号末端调节激酶（P-ERK）。结果与对照组相比，NE组中MUCSAC与MMP9的基因转录（0．83±0．17，0．79±0．16）和蛋白表达水平（0．84±0．15，0．88±0．16）明显高（均P〈0．01），并且MMP9的活性指标高（392．33±18．33，P〈0．01），而pro—MMP9蛋白含量低（0．17±0．10，P〈0．01），TIMP-1含量未见明显改变，P—EGFR（0．86±0．23）和P—ERK（0．85±0．22）蛋白水平明显高（均P〈0．01）；与NE组相比，AZT＋NE组MUC5AC与MMP9的基因转录（0．36±0．15，0．41±0．09）和蛋白表达水平（0．30±0．08，0．37±0．14）明显低（均P〈0．01），MMP9活性也较低（295．33±14．54，P〈0．01），pro—MMP9（0．46±0．14）和TIMP-1（0．67±0．17）蛋白含量高（均P〈0．05），p-EGFR的蛋白水平未见明显改变，而p-ERK蛋白水平低（0．40±0．19，P〈0．01）；与NE组相比，BIBX1522＋NE组中除MIJC5ACmRNA（0．37±0．14）、MMP9mRNA（0．37±0．13）、p-EGFR（0．36±0．13）和p-ERK（0．37±0．18）明显低外（均P〈0．01），其余指标无明显改变，差异无统计学意义。结论AZT能抑制气道上皮HBE16细胞内MMP9的活性及其产生，由此发挥抑制气道黏液高分泌的作用。

甘草酸对白细胞介素13诱导的大鼠气道黏液高分泌的作用

目的探讨甘草酸对白细胞介素13（IL-13）诱导的气道黏液高分泌的作用。方法sD大鼠50只用随机数字表法随机分为5组：对照组、IL-13组和不同浓度（25、50、75mg／kg）甘草酸组。通过黏液组化染色，采用形态定量法计算气道上皮组织染色阳性部分表达强度积分；体外培养人支气管上皮细胞株HBE-16细胞，分为6组：阴性对照组（生理盐水）、IL-13对照组（10斗∥L的IL-13±生理盐水）和不同浓度甘草酸干预组（10μg/L的IL-13分别加25、50、75μmol／L甘草酸）、阳性对照组（10μg／L的IL-13±25μmol／L唑泊司他），通过反转录-PCR、Western印迹、荧光法和活性氧细胞渗透性指示剂（CM—H。DCFDA）探针的荧光强度分别检测各组HBE-16细胞黏蛋白（MUC）5ACmRNA、MUC5AC蛋白表达及细胞内的醛糖还原酶（AR）活性和活性氧（ROS）相对表达水平。结果体内实验：各组气道上皮组织染色阳性细胞表达强度积分分别为0．12±0．03、0．87±0．13、0．56±0．08、0．46±0．06、0．35±0．04，不同浓度甘草酸组明显低于IL-13组（均P〈0．05），并有剂量依赖性；IL-13组明显强于对照组（P〈0．05）。体外实验：各组HBEl6细胞的AR活性及48h时的ROS相对表达水平分别为0．156±0．021、0．692±0．039、0．436±0．019、0．323±0．042、0．290±0．027和5．127±0．033、24．257±3．263、11．966±0．283、8．892±0．521、6．426±0．173，IL-13对照组明显高于阴性对照组（P〈0．05），不同浓度甘草酸干预组明显低于IL．13对照组（均P〈0．05）；各组HBEl6细胞MUC5ACmRNA和MUC5AC蛋白表达分别为0．82±0．05、3．22±0．12、2．57±0．34、2．09±0．54、1．58±0．22和0．18±0．04、0．65±0．15、0．48±0．11、0．33±0．19、0．26±0．06，IL-13对照组明显高于阴性对照组（P〈0．05），不同浓度甘草酸干预组明显低于IL-13对照组（均P〈0．05）。结论甘草酸可抑制IL-13诱导的MUC5ACmRNA和蛋白质的表达，抑制气道黏液高分泌。

冷空气联合香烟烟雾吸入诱导大鼠气道黏液高分泌的机制及药物的干预作用

目的探讨冷空气联合香烟烟雾吸入诱导大鼠气道黏液高分泌的机制及雪莲、布地奈德对该过程的干预作用。方法sD大鼠70只被随机分为7组：A组为对照组；B组为冷空气刺激组（吸入-18℃冷空气，3h／d，持续40d）；C组为香烟烟雾吸入组（吸人香烟烟雾，0．5h／d，持续40d）；D组为冷空气刺激＋香烟烟雾吸人组；E组为冷空气刺激＋香烟烟雾吸入＋雪莲干预组（腹腔内注入雪莲注射液0．8mg／kg，1次／d，持续40d）；F组为冷空气刺激＋香烟烟雾吸人＋布地奈德干预组（吸入布地奈德，0．5mg／kg，1次／d，持续40d）；G组为冷空气刺激＋香烟烟雾吸入＋雪莲＋布地奈德干预组（药物用法同前）。实时荧光定量PCR法检测各组大鼠支气管上皮内TRPM8mRNA相对水平，免疫组化法、Western印迹法检测各组大鼠支气管上皮内TRPM8蛋白相对水平，酶联免疫吸附法检测支气管肺泡灌洗液（BALF）中黏蛋白（MUC）5AC、白细胞介素8（IL-8）和肿瘤坏死因子or．（TNF-α）表达。结果A—G组支气管上皮内TRPM8mRNA相对表达量分别为1．00±0．00、0．98±0．07、2．27±0．29、2．31±0．30、1．55±0．38、1．66±0．40、1．31±0．23；免疫组化法和Western印迹法检测TRPM8蛋白相对表达量结果分别为0．16±0．05、0．16±0．04、0．22±0．06、0．25±0．05、0．17±0．04、0．18±0．03、0．15±0．05和0．25±0．04、0．24±0．03、0．58±0．06、0．56±0．09、0．41±0．09、0．39±0．07、0．20±0．06；c、D组均显著高于A组，E、F、G组均显著低于D组（均P〈0．05）。A～G组BALF中MUC5AC水平分别为（57±6）、（69±5）、（66±4）、（185±43）、（142±30）、（147±36）、（60±11）μg/mg，IL-8水平分别为（58±14）、（146±38）、（134±29）、（379±101）、（262±67）、（294±70）、（81±27）ng／L，TNF—or．水平分别为（153±28）、（208±90）、（274±64）、（600±113）、（458±96）、（498±84）、（169±65）ng／L；B、C、D组均显著高于A组，E、F、G组均显著低于D组（均P〈0．05），且香烟烟雾吸入与冷空气刺激、雪莲与布地奈德具有协同作用。结论冷空气刺激通过激活由香烟烟雾吸人所诱导的高水平TRPM8通道使前炎性细胞因子及MUC5AC呈现过度释放状态；雪莲、布地奈德对该过程具有协同性抑制作用。

鞘氨醇激酶1对肿瘤坏死因子α诱导的气道黏蛋白5AC的调节作用

目的探讨鞘氨醇激酶1（SphK1）对肿瘤坏死因子α（TNF—α）诱导的气道黏蛋白（MUC）5AC的调节机制。方法培养正常人气道上皮细胞HBE16，给予SphK1特异性抑制剂N，N-二甲基鞘氨醇（DMS）处理及转染SphK1的小干扰RNA（siRNA）后，再各施以TNF-α刺激，四甲基偶氮唑盐法检测各组细胞增殖活力，Westernblot法检测各组SphK1、环氧化酶2（COX-2）、磷酸化P38（P—P38）、磷酸化细胞外信号调节激酶（p-ERK）和IKBα蛋白相对含量，酶联免疫分析法检测各组MUC5AC、前列腺素E2（PGE2）和环单磷酸腺苷（cAMP）的相对含量，荧光素酶报告基因系统测定cAMP反应结合蛋白（CREB）和核因子-κB（NF-κB）的相对活性，RT-PCR检测各组SphK1和SphK1 mRNA的表达水平，免疫荧光法检测胞内MUC5AC含量。结果与对照组相比，TNF．d组的SphK1 mRNA和蛋白水平显著升高（均P〈0．01），COX-2、PGE2、cAMP、P—P38和p-ERK的含量明显增加（均P〈0．01），IkBα含量明显降低（P〈0．01），CREB和NF—KB的活性明显增强（均P〈0．01），MUC5AC mRNA和蛋白含量亦显著高于对照组（均P〈0．01）；与TNF-α组相比，给予DMS处理后COX-2、PGE2、cAMP、P—P38和p-ERK的含量明显降低（均P〈0．01），IkBα含量显著增加（P〈0．01），CREB和NF-κB的活性明显减弱（均P〈0．01），MUC5AC mRNA和蛋白含量也显著降低（均P〈0．01），转染SphK1 siRNA后上述指标出现同DMS处理一致的变化（均P〈0．01）。结论SphK1参与调节了TNF-α所诱导的MUC5AC高表达过程中的主要信号因子及转录因子的表达，可能是MUC5AC合成及分泌过程中的重要调节因子。

渗透压反应增强子结合蛋白对高渗下人气道上皮细胞黏液分泌的影响

目的探讨高渗刺激下渗透压反应增强子结合蛋白（OREBP）对热休克蛋白（HSP）70的转录调控及对黏液分泌的影响。方法采用体外培养的人气道上皮细胞HBE16为实验对象，分时程施加高渗条件，Western印迹检测OREBP和HSP70—2蛋白水平，ELISA检测培养上清黏蛋白（MUC）5AC分泌；进一步构建系列截短和定点突变的HSP70-2启动子荧光素酶报告基因质粒，将其与OREBP的小片段干扰RNA（siRNA）共转染HBE16细胞，求证渗透压反应增强子（ORE）在HSP70-2基因启动子上游的结合位点及对MUC5AC分泌的影响。结果600mOsm／L高渗盐水培养HBE16细胞3h后，OREBP、HSP70-2和培养上清MUC5AC蛋白相对含量分别为（0．54±0．07，0．20±0．08，0．17±0．04），与对照组（0．21±0．05，0．15±0．06，0．13±0．04）相比显著增加到2．57、1．33和1．31倍（均P〈0．05），且随高渗培养时间延长而增加，6h时分别增加到2．81、3．07、3．77倍（均P〈0．01），9h时分别增加到3．57、5．13、4．00倍（均P〈0．01），12h时分别增加到4．24、5．33、4．54倍（均P〈0．01）；siRNA抑制OREBP表达48h后，高渗刺激下的OREBP、HSP704和上清MUC5AC蛋白相对含量为（0．36±0．08，0．33±0．08，0．24±0．05），和对照组（0．95±0．27，0．75±0．22，0．58±0．22）相比显著减少（蛋白抑制率分别为62％、56％和59％）（P〈0．05，P〈0．01，P〈0．05）；荧光素酶测定表明HSP70—2启动子上游-353至-66区域存在一个关键的ORE位点；定点突变失活-93区域的ORE位点可引起高渗诱导条件下HSP70-2启动子的活性显著降低（P〈0．01）。结论高渗盐水诱导OREBP通过与HSP704启动子上-93位ORE结合而激活HSP70—2转录并促进HBE16细胞MUC5AC高分泌。

神经调节蛋白1β在白细胞介素1β所致气道黏液高分泌中的作用

目的探讨神经调节蛋白1p（NRG-1p）在白细胞介素1β（IL-1β）诱导的气道黏液高分泌中的作用。方法用IL-1β刺激人气道上皮细胞株HBEl6细胞构建黏液高分泌模型，逆转录PCR法检测NRG-1βmRNA和黏蛋白（MUC）5ACmRNA，ELISA法检测NRG-1β和MUC5AC蛋白水平。用NRG-1β刺激后，ELISA法检测MUC5AC表达，Western印迹法检测磷酸化人表皮生长因子受体（ErbB）1～4。预先分别给予ErbBl—4抗体及p38触分裂原活化蛋白（MAPK）特异性抑制剂、细胞外信号调节蛋白（ERK）1／2特异性抑制剂、丝裂原压力活性蛋白激酶（MSK）1特异性抑制剂、环磷酸腺苷（c—AMP）反应原件结合蛋白（CREB）单克隆抗体，再经NRG-1β刺激后，ELISA法检测MUC5AC蛋白表达。结果IL-113显著增加NRG-1β、MUC5ACmRNA水平及其蛋白表达，且在蛋白水平呈现浓度正相关性。单独给予NRG-1β（1、10、100、200nmol／L）刺激HBEl6细胞，MUC5AC蛋白表达（0．3284-0．055、0．364±0．086、0．650±0．134、0．586±0．068）较对照组（0．227±0．019）显著增加，差异均有统计学意义（均P〈0．05），同时磷酸化ErbB2、3呈阳性表达，而磷酸化ErbBl、4呈近似阴性表达。预先给予ErbB2、3抗体、p38MAPK特异性抑制剂、ERKl／2特异性抑制剂和MSKl抑制剂、CREB抗体再给予NRG-1β母刺激者MUC5AC蛋白表达（0．221±0．033、0．238±0．044、0．386±0．021、0．352±0．022、0．294±0．017、0．252±0．019）较单独给予NRG-1β（0．650±0．134）显著降低，差异均有统计学意义（均P〈0．05）。结论IL—β导致气道黏液高分泌可能通过NRG．1β／ErbB2、3异二聚体信号通路，并激活后续的MAPK／MsKl／cREB信号路径实现。

丙烯醛调控糖皮质激素受体类小泛素化水平对气道黏液高分泌的影响

目的探讨丙烯醛调控的糖皮质激素受体（GRs）类小泛素（SUMO）化水平对气道黏液高分泌的影响。方法构建重组真核表达载体质粒pcDNA3．1．EGFP．flag．SUM01，酶切电泳鉴定。常规培养16HBE细胞，随机分为9组：A：空白对照组；B：丙烯醛刺激组；C：地塞米松组；D：丙烯醛刺激＋地塞米松组；E：SUMO相关修饰物1（SUM01）转染组；F：空质粒转染组；G：SUM01转染＋丙烯醛刺激组；H：SUM01转染＋丙烯醛刺激＋地塞米松组；I：空质粒转染＋丙烯醛刺激＋地塞米松组。每个实验组设5复孔，重复4次实验用于统计学分析。荧光显微镜下观察转染成功率，通过免疫共沉淀以及Western印迹法分析各实验组GRsSUMO化水平的变化，反转录-PCR法比较各实验组中黏蛋白（MUC）5AC转录水平的差异。用酶联免疫吸附法测定细胞培养上清液中MUC5AC的分泌量。结果B组GRsSUMO化水平（0．079±0．023）低于A组（0．446±0．068）（t=-23．13，P=0．000）；D组GRsSUMO化水平（0．574±0．018）低于c组（0．843±0．028）（t=-36．34，P=0．000）。H组的MUC5ACmRNA转录水平（0．330±0．063）低于D组（0．617±0．190）（q=-7．80，P=0．000）。细胞培养上清液中MUC5AC分泌水平显示，G组与B组差异无统计学意义，而H组[（0．416±0．092）μg／L）]显著低于D组[（0．663±0．104）μg／L]和G组[（0．740±0．343）μg／L]（q=-7．31，-9．59；P=0．001，0．000）。结论丙烯醛可下调GRsSUMO化水平，并降低地塞米松对MUC5AC转录的抑制作用。

白细胞介素-1受体相关激酶通过TLR-4/MyD88信号通路调控内毒素诱导的气道黏液高分泌

目的探讨白细胞介素-1受体相关激酶(interleukin-1 receptor associated kinase,IRAK)在细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的气道黏液高分泌中的作用及其机制。方法采用特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染,下调Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)-4、IRAK在人气道上皮细胞株BEAS-2B中的表达,采用逆转录–聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)检测细胞内黏蛋白5AC(mucin 5AC,MUC5AC)mRNA转录水平,酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞上清液中MUC5AC分泌量。利用蛋白印迹法检测胞内信号蛋白IRAK磷酸化水平及核因子(nuclear factor,NF)-κB p65的核转位情况。结果经LPS刺激后BEAS-2B细胞内IRAK磷酸化水平显著增高,使用siRNA下调TLR-4表达,可部分降低IRAK磷酸化水平(P<0.05);经LPS刺激,NF-κB p65趋向核内分布,使用siRNA下调TLR-4或IRAK可部分削弱NF-κB p65核内分布(P<0.05);RT-PCR及ELISA结果也显示,经LPS刺激后TLR-4缺陷株MUC5AC mRNA转录水平(0.36±0.05)、分泌量[(0.33±0.04)μg/L],IRAK缺陷株MUC5AC mRNA转录水平(0.48±0.05)、分泌量[(0.42±0.05)μg/L],IRAK激酶抑制剂组MUC5AC mRNA转录水平(0.57±0.07)、分泌量[(0.51±0.06)μg/L]均分别低于野生型BEAS-2B组[0.82±0.09,(0.76±0.09)μg/L;均P<0.05]。结论IRAK作为TLR受体依赖信号通路上游的重要调控蛋白,参与LPS诱导的气道黏液高分泌。

冷刺激对细颗粒物致气道上皮炎症反应的增敏效应及冷诱导RNA结合蛋白的转录后调控机制

目的探讨冷刺激对细颗粒物(PM2.5)致气道上皮炎症反应的增敏效应及冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)可能的转录后调控机制。方法采用在体、离体实验,并结合人体手术切除肺组织标本的观察,将动物模型和气道上皮细胞16HBE各分为4组(每组n=8),即空白对照组、5℃/18℃组、PM2.5组、5℃/18℃+PM2.5组,分别以酶联免疫吸附试验、实时荧光定量聚合酶链反应、蛋白印迹检测各组气道上皮细胞和大鼠支气管/肺组织的代表性炎症因子及CIRP mRNA和蛋白的表达规律,并进一步采用细胞免疫荧光技术观察CIRP变化的时相动力学规律。同时采用免疫组织化学的方法观察各组大鼠及人体支气管/肺组织CIRP的定位和表达规律。结果在体实验中,相较于对照组,5℃组和PM2.5组CIRP、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α的mRNA及蛋白均呈现表达水平增高的现象(均P<0.05),而5℃组+PM2.5组相应的mRNA及蛋白表达则最为显著(均P<0.01)。在离体实验的各组实验结果中亦出现同样的规律。CIRP主要定位于胞核内,相较于对照组,18℃组和PM2.5组均出现CIRP胞内移位趋势,而18℃+PM2.5组CIRP胞内移位现象最为明显。在大鼠支气管/肺组织的免疫组织化学中,5℃组CIRP的表达高于对照组,PM2.5组CIRP的表达量相较于对照组也有所增加,而5℃+PM2.5组CIRP的表达量变化最为显著。此外,CIRP在正常人群和慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)患者支气管上皮黏膜中均有表达,且主要位于气道黏膜上皮细胞胞核内。其中慢阻肺患者CIRP的表达量较正常人群显著升高。结论冷刺激对PM2.5所致的气道上皮炎症反应有增敏效应,而CIRP由胞核移位至胞浆形成的转录后调控可能是其重要机制。

钙敏感受体在缺氧诱导气道黏液高分泌中的作用

目的 探讨钙敏感受体（CaSR）在缺氧诱导的气道黏液高分泌中的作用.方法 通过缺氧培养箱（94％ N2、1％ O2、5％ CO2、37℃）培养人气道上皮细胞HBE16的方法复制细胞缺氧模型.转染CaSR的小干扰RNA （siRNA）及预先给予CaSR特异性激动剂CaCl2、磷脂酶C信号通路不同的抑制剂：Gαq/11蛋白特异性抑制剂（YM-254890）,磷脂酶C特异性抑制剂（U73122）,三磷酸肌醇受体（IP3R）特异性抑制剂（2-APB）及细胞内Ca2＋螯合剂（BAPTA-AM）后,各组细胞再施以缺氧处理.采用反转录-PCR检测黏蛋白（MUC）5AC mRNA的转录水平,Western印迹法检测CaSR蛋白的表达水平,酶联免疫吸附（ELISA）法检测MUC5AC蛋白的相对含量,共聚焦显微镜观察细胞内Ca2＋浓度的变化.结果 缺氧组CaSR蛋白相对表达水平（0.423 ±0.028）显著高于对照组（0.185 ±0.036）（t=12.75,P＜0.001）;细胞内Ca2＋浓度、MUC5AC蛋白相对含量及MUC5AC mRNA相对表达水平[（154.2±11.4） nmol/L、（0.624±0.063） μg/L、0.736±0.045]也显著高于对照组[（67.5±2.8）nmol/L、（0.257 ±0.051）tμg/L、0.321±0.034]（t=18.04、11.06、18.05,均JP＜0.001）.CaCl2能上调缺氧引起的上述作用,转染CaSR siRNA能够下调缺氧引起的上述效应（均P＜0.001）.预先给予YM-254890、U73122、2-APB、BAPTA-AM处理细胞,细胞内Ca2＋浓度、MUC5AC蛋白相对含量及MUC5AC mRNA相对表达水平均显著低于单纯缺氧组（均P＜0.05）.结论 CaSR可通过Gαq/11/磷脂酶C/三磷酸肌醇/细胞内Ca2＋信号通路参与缺氧诱导的气道黏液高分泌.

气道剪应力作用下黏蛋白5AC胞外极向分泌的主要介导分子

目的探讨气道剪应力（SS）作用下黏蛋白（MUC）5AC胞外极向分泌的主要介导分子。方法常规培养16HBE细胞，使用Stata软件产生随机数字随机分为5组并分别进行如下处理：A组（对照组）：10％胎牛血清（FBS）＋DMEM高糖培养液继续培养，不再予任何刺激；B组（SS组）：只给予节律性旋转装置产生的SS刺激；C组[SS＋Rac-1特异性抑制剂（NSC23766）组]：给予SS刺激前30min，加入NSC23766（10μmol／L）；D组（SS＋微丝肌动蛋白解聚剂组）：给予SS刺激前30min，加入细胞松弛素D（100μg/L）；E组[SS＋皮层肌动蛋白结合蛋白（Cortactin）小干扰RNA（siRNA）转染组]：用成功转染Cortactin-siRNA的细胞予以SS刺激。每个实验组设6个复孔，重复3次实验用于统计学分析。采用节律性旋转装置模拟呼吸时气流对气道产生的SS作用。用Cortactin-siRNA转染抑制Cortactin功能。酶联免疫吸附试验（ELISA）法测定细胞培养上清液中MUC5AC的胞外分泌量；Western印迹法检测Cortactin及其磷酸化（p-Cortactin）水平和转染效果；激光共聚焦显微镜观察微丝肌动蛋白的聚合情况。结果Cortactin—siRNA转染成功。A、B、C、D、E组MUC5AC相对含量分别为0．210±0．013、0．631±0．025、0．473±0．112、0．330±0．067、0．272±0．019，B组均显著高于其他各组（P=0．000、0．043、0．000、0．000）；B组Cortactin相对表达水平为0．670±0．048，显著高于E组的0．132±0．014（P〈0．01），但与A、C、D组的0．641±0．016、0．622±0．012、0．653±0．027比较差异均无统计学意义（均P〉0．05）；B组p-Cortactin相对表达水平为0．582±0．067，显著高于A、C、E组的0．131±0．011、0．393±0．045、0．170±0．016（P=0．000、0．021、0．000），而D组（0．511±0．029）与B组差异无统计学意义（P=0．246）。结论Rac-1、Cortactin和微丝肌动蛋白是气道SS作用下MUC5AC胞外极向分泌的主要介导分子。