克拉霉素抑制气道黏液高分泌细胞内机制的研究

目的研究克拉霉素(CLA)抑制气道黏液高分泌的细胞内分子机制。方法运用中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)刺激人类支气管上皮细胞株HBE16构建气道黏液高分泌模型,予以CLA和信号末端调节激酶1/2(ERK1/2)特异性抑制剂U0126进行干预,采用RT-PCR检测细胞内黏蛋白(MUC)5AC mRNA表达水平,ELISA法检测细胞上清液中MUC5AC蛋白含量,Western blotting检测细胞内磷酸化表皮生长因子受体(p-EGFR)、磷酸化ERK(p-ERK)、磷酸化c-Jun N端激酶(p-JNK)、磷酸化P38(p-P38)的含量。结果克拉霉素和U0126均能降低气道黏液高分泌模型中MUC5AC基因转录和蛋白表达水平,并且使p-ERK表达水平下降,但对p-EGFR、p-JNK、p-P38的表达无明显作用。结论克拉霉素能抑制细胞内信号通路分子ERK1/2磷酸化水平,从而减少了气道上皮细胞产生MUC5AC,由此发挥抑制气道黏液高分泌的作用。

机械牵张对人气道黏膜上皮细胞黏蛋白5AC表达的影响及其信号通路机制研究

目的观察机械牵张对人气道黏膜上皮细胞黏蛋白(MUC)表达的影响,并对其信号转导机制进行初步探讨。方法采用多功能小型生物撞击机构建体外培养的人气道黏膜上皮细胞牵张模型,分别给予丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的三条主要通路抑制剂:JNK抑制剂(SP600125)、p38蛋白激酶抑制剂(SB203580)及ERK1/2抑制剂(U0126)(浓度均为30μmol/L),并设未进行机械牵张的对照组和单纯机械牵张组。采用流式细胞仪检测牵张前后胞内游离Ca2+荧光强度的变化,激光共聚焦显微镜观察胞内游离Ca2+的分布情况,并分别采用RT-PCR和ELISA方法检测MUC5AC mRNA表达和蛋白分泌量。结果牵张能显著升高人气道黏膜上皮细胞胞内Ca2+浓度、MUC5AC mRNA和蛋白表达(均P<0.01)。U0126和SB203580能抑制牵张所致MUC5AC mRNA和蛋白表达增加(均P<0.01)。结论机械牵张能升高人气道黏膜上皮细胞黏蛋白表达,其机制可能与胞内Ca2+浓度的升高以及ERK1/2、p38 MAPK信号通路有关。

Elafin基因重组气道上皮调节脂多糖诱导的人气道黏液高分泌

目的探讨天然内生多肽Elafin对脂多糖诱导的气道黏液高分泌的调节机制。方法构建人Elafin重组质粒pEGFP-N1-Elafin,转染正常人支气管上皮细胞HBE16,给予脂多糖(LPS)刺激,激光共聚焦扫描显微镜检测Elafin蛋白含量,Western blot法检测IκBα蛋白含量;荧光素酶报告基因检测系统测定核转录因子-κB(NF-κB)活性;RT-PCR检测Elafin和黏蛋白(MUC)5AC mRNA表达水平;ELISA法分析MUC5AC蛋白相对含量。结果成功构建内生多肽Elafin真核表达载体pEGFP-N1-Elafin并转染HBE16细胞。转染重组Elafin后Elafin蛋白含量及mRNA水平明显增加。与对照组相比,LPS刺激组IκBα蛋白含量降低,NF-κB相对活性明显增强,MUC5AC蛋白含量及mRNA水平也显著增加。转染重组Elafin后再予以LPS刺激,与单纯LPS刺激组相比,IκBα蛋白含量明显增加,NF-κB相对活性显著降低,MUC5AC蛋白含量及mRNA水平也明显降低。结论天然内生多肽Elafin重组气道上皮可下调NF-κB的活性,降低脂多糖诱导的气道黏液高分泌。

Ezrin介导中性粒细胞弹性蛋白酶诱导的人气道上皮细胞株分泌黏蛋白增加

目的探讨膜连接蛋白Ezrin在中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)诱导气道黏液高分泌的作用及相关调节机制。方法以中性粒细胞弹性蛋白酶刺激培养的人气道上皮HBE16细胞,ELISA法、real-time PCR法测定黏蛋白(MUC)5AC的蛋白及mRNA水平。免疫荧光法检测Ezrin蛋白含量。结果 NE刺激30 min后MUC5AC mRNA表达增强,细胞中及培养上清中黏蛋白MUC5AC的含量均显著高于对照组(P<0.01);转染Ezrin永久磷酸化载体pEGFPN1-Ezrin-T567D的细胞经NE刺激后,胞质内磷酸化Ezrin表达明显增强,且胞膜分布增多。同时,细胞培养上清液中的MUC5AC蛋白含量亦显著高于单纯NE组(P<0.01)。遏制Ezrin磷酸化pEGFP-N1-Ezrin-T567A载体转染组在NE刺激后,Ezrin蛋白与pEGFP-N1-Ezrin-T567D组相比有明显减少,且未出现向胞膜聚集的趋势,同时分泌至培养上清的MUC5AC蛋白也有明显减少(P<0.01),同时伴随胞质内MUC5AC蛋白有所增加(P<0.05)。结论 Ezrin蛋白参与了NE诱导的MUC5AC蛋白分泌,是气道上皮细胞MUC5AC分泌的重要调控分子。

高渗诱导人气道上皮细胞系黏液高分泌

目的研究高渗条件对正常人气道上皮细胞(HBE)黏蛋白(MUC)5AC分泌的影响,以及蛋白激酶C(PKC)-热休克蛋白(HSP)70信号途径在其中的可能作用。方法 采用高渗盐水诱导培养HBE16细胞的方法复制黏液高分泌体外模型,分别用PKCμ抑制剂G 6976、PKCα抑制剂Safingol、PKCβ抑制剂LY333531和PKCδ抑制剂Rot-tlerin干预HBE16细胞。Western blot检测HSP70-2的蛋白含量;RT-PCR检测人HSP70-2转录水平;ELISA检测培养上清MUC5AC蛋白含量c各高渗组的培养上清MUC5AC蛋白含量、HSP70-2蛋白和转录水平较对照组显著升高,并随着培养时间的延长而逐渐增加(P<0.05)。G 6976处理组的上述指标显著降低(P<0.01),但仍高于对照组(P<0.05);而Safingol、LY333531和Rottlerin处理组均无改变。结论 高渗盐水可诱导人气道上皮细胞MUC5AC的高分泌,HSP70-2系通过PKC中的μ亚型在该过程中起重要作用的。

呼吸机机械通气对兔气道黏蛋白表达的影响

目的观察呼吸机机械通气对黏蛋白(MUC5AC)表达的影响,并对其机制进行初步探讨。方法日本大耳兔随机分为对照组、机械通气1、3、6、12和24 h组以及2、5和10 cm H2O呼气末正压(PEEP)组。取支气管肺泡灌洗液(BALF),用ELISA和RT-PCR法检测BALF中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素(IL)-8、MUC5AC蛋白和mRNA的水平,计数BALF中多型核粒细胞,底物检测法测定中性粒细胞弹力酶(NE)活性。结果机械通气能显著增强MUC5AC的分泌(P<0.05)。通气3 h TNF-α表达至峰值,随后逐渐下降(P<0.05)。通气6 h IL-8表达至峰值,随后逐渐下降(P<0.05)。通气12 h后多型核粒细胞数及中性粒细胞弹力酶活性显著升高,24 h后回降(P<0.05)。随着PEEP的增加,TNF-α、IL-8、MUC5AC mRNA的表达和蛋白含量、多型核粒细胞数和NE活性均随之升高(P<0.05)。结论机械通气能促进气道黏膜上皮细胞分泌MUC5AC,其机制可能与机械通气引发炎性反应有关。

慢性阻塞性肺病患者冷敏受体高表达及其临床意义

目的探讨瞬时受体电位蛋白-8(TRPM8)在慢性阻塞性肺病(COPD)患者与正常人气道黏膜上皮组织的表达差异及其信号传导机制。方法免疫组化法观察TRPM8蛋白在气道黏膜上皮分布特点及表达差异,RT-PCR及Western bolt检测TRPM8 mRNA及其蛋白表达。体外培养16HBE细胞(n=5),分为对照组(37℃)、冷刺激组、冷刺激+BCTC组、冷刺激+转染TRPM8 shRNA组、冷刺激+转染对照组,以18℃冷空气刺激细胞,激光共聚焦检测胞内Ca2+相对浓度。结果 TRPM8蛋白主要分布于支气管黏膜上皮基底细胞或小颗粒细胞的细胞膜,COPD组累积吸光度/面积比值、TRPM8 mRNA及其蛋白表达量显著高于对照组(P<0.05)。冷刺激组的Ca2+浓度显著高于对照组(P<0.05),BCTC、转染TRPM8 shRNA组较前者明显下降(P<0.05)。结论 COPD患者气道黏膜上皮TRPM8蛋白高表达可能是其对冷空气敏感的重要原因之一。

Elafin在肿瘤坏死因子-α诱导的炎性反应中的抗炎机制

目的探讨Elafin的抗炎机制。方法体外培养人支气管上皮细胞系16HBE细胞,将已构建好的pEG-FP-N1-Elafin载体转染到细胞中,并以空质粒载体作其对照,以外源性肿瘤坏死因子(TNF)-α作为刺激物共同孵育。间接免疫荧光细胞化学法结合激光共聚焦显微镜检测细胞核中核因子(NF)-κB的活性,ELISA检测细胞上清液中炎性介质(选取IL-1β、IL-8作为代表)的含量,免疫共沉淀法结合Western blot检测小泛素样修饰蛋白(SU-MO)-1-p-IκBα含量。结果重组质粒组的细胞中NF-κB的活性和IL-1β、IL-8的生成量与空质粒载体组细胞相比明显降低,而SUMO-1-p-IκBα的含量则显著升高(P<0.01)。结论Elafin能够通过促进IκBα的类泛素化阻止NF-κB的活化,下调前炎性介质的生成,从而发挥其抗炎作用。

Elafin在人支气管上皮细胞系16HBE胞质内对黏蛋白5AC生成的影响

目的探讨Elafin在胞质内对表皮生长因子(EGF)诱导的黏蛋白(MUC)5AC生成的影响及其作用机制。方法体外培养人支气管上皮细胞系16HBE,将已构建好的pEGFP-N1-Elafin载体通过LipofectamineTM2000转染到16HBE细胞中,以转染空质粒载体的16HBE细胞作为对照,均给予外源性EGF作为刺激物共同孵育。以RT-PCR和ELISA分别检测细胞内黏蛋白(MUC)5AC mRNA水平和MUC5AC含量。间接免疫荧光细胞化学法结合激光共聚焦显微镜检测细胞核中核因子(NF)-κB的活性。免疫共沉淀法结合Western blot检测SUMO-1-p-IκBα含量。结果转染重组质粒的细胞中MUC5ACmRNA水平、MUC5AC的含量(0.36±0.09)以及NF-κB的活性显著低于转染空载体的对照组细胞(MUC5AC的含量0.55±0.07)(P<0.01),而SUMO-1-p-IκBα的含量则显著高于后者(P<0.01)。结论 Elafin能够通过促进p-IκBα的类泛素化阻止NF-κB的活化,从而下调MUC5AC的生成。

JNK信号通路介导机械牵张引发的肺泡巨噬细胞炎性因子表达

目的观察不同机械牵张应力对大鼠肺泡巨噬细胞白介素-6(IL-6)和巨噬细胞炎症蛋白-2(MIP-2)的影响,并探讨C-JUN氨基末端激酶(JNK)对机械牵张诱导的大鼠肺泡巨噬细胞IL-6和MIP-2表达的调控作用。方法采用支气管肺泡灌洗的方法取得大鼠肺泡巨噬细胞,并建立体外大鼠肺泡巨噬细胞梯度应力的机械牵张模型,应用RT-PCR和Western印迹方法观察IL-6和MIP-2的表达。进一步应用JNK特异性抑制剂SP600125,p38特异性抑制剂SB203580,及ERK特异性抑制剂PD98059给予同期干预,检测干预效果。结果随着机械牵张应力的增大,肺泡巨噬细胞MIP-2 mRNA和其蛋白的表达递增(均P<0.05)。给予SP600125干预组大鼠肺泡巨噬细胞MIP-2 mRNA和蛋白表达较机械牵张处理组明显降低。SB203580干预组及PD98059干预组的肺泡巨噬细胞MIP-2 mRNA和蛋白水平较对照组明显升高,而与机械牵张处理组相比无明显变化。而IL-6 mRNA及其蛋白水平在上述各组中均无明显变化。结论大鼠巨噬细胞MIP-2的表达与机械牵张应力呈强度依赖性,JNK信号通路在周期性牵张诱导肺泡巨噬细胞表达释放MIP-2过程中起重要作用。

皮层肌动结合蛋白不同位点磷酸化对人气道上皮细胞黏蛋白5AC分泌的影响

目的:了解皮层肌动结合蛋白(cortical actin-binding protein,又称cortactin)在人气道上皮细胞黏蛋白(mucin,MUC)5AC分泌中的作用及不同磷酸化位点对其的影响。方法:培养人气道上皮细胞HBE16,以皮层肌动结合蛋白不同磷酸化位点突变载体转染细胞,并分为空白对照组、剪应力刺激组、剪应力+增强绿色荧光蛋白质粒(enhanced greenfluorescentproteinplasmid,p EGFP)-N1组、剪应力+p EGFP-N1-cortactin(Cort)组、剪应力+p EGFP-N1-Cort-Y421A组、剪应力+p EGFP-N1-Cort-Y470A组及剪应力+p EGFP-N1-Cort-Y486A组,剪应力设定为4 dynes/cm^2。采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、real-time PCR法测定转染前后各组细胞及培养上清中MUC5AC蛋白和m RNA水平,Western印迹检测各组皮层肌动结合蛋白及磷酸化皮层肌动结合蛋白含量;异硫氰酸荧光素(fl uorescein isothiocyanate,FITC)标记的鬼笔环肽染色观察丝状肌动蛋白(fi lamentous actin,F-actin)的分布情况。结果:4 dynes/cm^2剪应力刺激30 min后,细胞中磷酸化皮层肌动结合蛋白表达增加,在2 h时表达水平最高;剪应力刺激2 h后,MUC5AC m RNA表达增强,细胞及培养上清中MUC5AC的含量与空白对照组相比,各组均显著增加(均P<0.05);与剪应力刺激组相比,剪应力+p EGFP-N1-cortactin(Cort)组的细胞培养上清液中MUC5AC蛋白含量显著增加,F-actin在胞膜的分布也明显增多(均P<0.05),而胞质内MUC5AC蛋白及MUC5AC m RNA水平变化不大。与剪应力+p EGFP-N1-Cort组相比,剪应力+p EGFP-N1-Cort-Y421A组、剪应力+p EGFP-N1-Cort-Y470A组培养上清液中的MUC5AC蛋白含量有明显降低,F-actin在胞膜的聚集也有所减少(均P<0.05),而剪应力+p EGFP-N1-Cort-Y486A组中MUC5AC含量变化不明显(P>0.05)。结论:皮层肌动结合蛋白参与了剪应力诱导产生的人气道上皮细胞MUC5AC蛋白分泌,Tyr421和Tyr470位点磷酸化在其中可能起重要的作用。

Elafin真核表达载体的构建及其对气道粘液高分泌的调节

目的:构建天然内生多肽Elafin真核表达载体,探讨其对气道粘液高分泌的影响。方法:抽提Elafin行RT-PCR获取Elafin cDNA,双酶切后将片段装载到pMD18-T载体上。以pMD18-T-Elafin为模板行PCR反应,产物胶回收并双酶切后定向克隆至pEGFP-N1上,转化,筛选,双酶切鉴定重组质粒。将pEGFP-N1-Elafin转染正常人支气管上皮细胞HBE16,给予脂多糖(LPS)刺激,Western blot检测细胞内Elafin蛋白的相对含量,RT-PCR检测各组Elafin mRNA和粘蛋白(MUC)5AC mRNA表达水平,荧光素酶报告基因检测系统测定核转录因子-κB(NFκ-B)的活性;ELISA法分析各组细胞MUC5AC蛋白的相对含量。结果:成功构建Elafin真核表达载体,转染重组Elafin的HBE16细胞成功表达Elafin蛋白。LPS刺激可增强NF-κB的活性,该活性在转染重组Elafin后显著降低;MUC5AC蛋白含量及mRNA水平在LPS刺激后也显著升高,在转染重组Elafin后二者的表达水平明显降低。结论:Elafin真核表达载体成功构建,初步发现Elafin可通过降低NFκ-B的活性来下调MUC5AC的表达,为进一步深入研究其对气道粘液高分泌的调节机制奠定了基础。

黏着斑激酶在机械压力诱导的人气道上皮细胞黏液分泌中的作用

目的探讨黏着斑激酶(FAK)在机械压力诱导的人气道黏蛋白(MUC)5AC分泌中的作用。方法气液相界面培养人支气管上皮NHBE细胞,用Transwell压力实验装置间断性施压于NHBE细胞,黏着斑激酶(FAK)siRNA转染NHBE细胞,Western blot法检测FAK和p-ERK1/2蛋白含量,实时荧光定量PCR检测MUC5AC mRNA表达,ELISA法检测MUC5AC蛋白相对含量。结果与空白对照组相比,机械压力能显著升高MUC5AC mRNA及蛋白含量及p-ERK1/2蛋白相对表达水平(均P<0.01)。FAK siRNA可显著降低机械压力所诱导的MUC5AC mRNA及蛋白含量的升高及p-ERK1/2蛋白表达(P<0.01),但与转染FAK siRNA对照组相比,机械压力+转染FAK siRNA组细胞表达MUC5AC mRNA及蛋白水平和p-ERK1/2蛋白相对水平仍然是增加的(P<0.05),PD98059能显著抑制机械压力所诱导的MUC5AC mRNA及蛋白表达水平的升高(P<0.01)。FAK siRNA联合AG1478作用于NHBE细胞则可显著抑制机械压力诱导的MUC5AC mRNA和蛋白表达(P<0.01)。AG1478单独作用能有效降低由机械压力所诱导的上述指标的升高(P<0.05),但与AG1478对照组相比差异仍具有显著性。结论机械压力诱导的MUC5AC高表达的信号传导通路为ERK依赖的,FAK为ERK的上游信号分子。

钙敏感受体通过ERK信号通路参与低氧诱导的人气道上皮细胞黏液高分泌

目的探究钙敏感受体(Ca SR)在低氧诱导的气道黏液高分泌中的信号通路。方法低氧培养箱(37℃,94%N2-1%O2-5%CO2)培养人气道上皮细胞16HBE复制细胞低氧模型。分为对照组、低氧组、Ca SR特异性激动剂Ca Cl2+低氧组、对照siRNA+低氧组、Ca SR-siRNA+低氧组、细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路特异性抑制剂U0126+低氧组。RT-PCR检测黏蛋白(MUC)5AC的转录水平,Western blot检测Ca SR、ERK1/2及磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)的蛋白相对含量,ELISA检测MUC5AC的分泌水平,四甲基偶氮唑盐法(MTT)测定细胞的活性。结果Ca SR表达于人气道上皮细胞,转染特异性的Ca SR-siRNA明显抑制Ca SR的表达。低氧组p-ERK1/2、MUC5AC mRNA和MUC5AC蛋白的相对含量分别为(0.63±0.11、0.51±0.03、0.56±0.07)较对照组(0.27±0.04、0.18±0.04、0.25±0.06)显著增加(P<0.05)。Ca SR的激动剂Ca Cl2可进一步增强低氧引起的上述作用(P<0.05),而转染Ca SR-siRNA及给予ERK信号通路特异性抑制剂U0126可抑制低氧引起的上述效应(P<0.05)。结论 Ca SR可通过MEK/ERK1/2信号通路参与低氧诱导的气道黏液高分泌。

OGR1籍ERK信号通路参与酸性微环境致气道上皮细胞黏蛋白5AC表达

目的探讨气道酸性微环境诱导气道上皮细胞黏蛋白5AC表达的上游信号通路调节机制。方法体外培养人气道上皮细胞(16HBE),以氯化氢创造细胞酸性环境(pH 6.4),以细胞外信号调节激酶(ERK)特异性抑制剂PD88059及卵巢癌G蛋白耦联受体1(OGR1)siRNA进行干预,将细胞随机分为8组:对照组、酸刺激组、酸刺激+转染OGR1 siRNA组、pH 7.4+OGR1siRNA组、酸刺激+阴性siRNA组、pH 7.4+阴性siRNA组、酸刺激+PD98059组、pH 7.4+PD98059组。采用RT-PCR、ELISA法分别观察细胞黏蛋白(MUC)5AC转录水平及培养上清液中MUC5AC蛋白水平的改变;Western blot法检测OGR1蛋白及p-ERK蛋白的相对含量。结果酸刺激组内细胞MUC5AC转录及蛋白水平显著高于对照组(P值均<0.05),其OGR1及p-ERK蛋白含量较对照组亦明显增加,酸刺激+转染OGR1 siRNA组MUC5AC mRNA转录及蛋白水平显著低于酸刺激组(P值均<0.05),其p-ERK含量亦明显降低。而pH 7.4+OGR1 siRNA组MUC5AC蛋白含量及mRNA水平较pH7.4对照组无明显差别,其p-ERK含量也变化不大。酸刺激+PD98059组MUC5AC mRNA转录及蛋白水平显著低于酸刺激组(P值均<0.05),而pH 7.4+PD98059组较对照组MUC5AC mRNA转录及蛋白水平无明显差异。结论 OGR1可能通过激活ERK信号通路参与气道酸性微环境所致的人气道黏膜上皮细胞MUC5AC表达。

节律性压力波对家犬气道黏蛋白分泌平衡的影响及其机制

目的:观察不同压力对家犬气道黏液层黏蛋白(MUC)分泌的影响,并初步探讨其参与机制。方法:24只健康家犬行双腔支气管导管插管,并随机分为4组(n=6)。A组家犬正常呼吸的频率及压力双侧通气(A1,A2);B组一侧不通气(B1),另一侧予以过量通气(B2);C组预先张力敏感性阳离子通道4(TRPV4)阻断剂钉红(RR)后按A组通气模式通气(C1,C2);D组预先TRPV4阻断剂RR处理后按B组通气模式通气(D1,D2)。通气12 h后,ELISA检测3组支气管灌洗液(BALF)中MUC(2,5AC和5B)蛋白含量;RT-PCR检测支气管肺组织匀浆中MUC(2,5AC和5B)mRNA转录水平。结果:与正常通气的A2组比较,过量通气的B2组家犬BALF中3种MUC蛋白含量显著升高,且以MUC5AC为主(P<0.05);与A1组比较,未通气的B1组则明显下降(P<0.05)。与A1,A2组比较,给予RR处理后的C1,C2组蛋白含量均明显降低(P<0.05)。与过量通气的B2组比较,给予TRPV4特异性阻断剂处理后再过量通气的D2组3种MUC蛋白含量亦明显下降(P<0.05)。与A2组比较过量通气的B2组肺组织MUC(2,5AC和5B)mRNA表达均明显上调(P<0.05);与A1,A2比较,给予RR处理后C1,C2组肺组织3种MUC mRNA转录水平显著下降(P<0.05);给予RR预处理后与B2组相比,D2组内MUC mRNA转录水平显著下调(P<0.05)。结论:节律性压力波参与维持家犬气道上皮黏液层黏蛋白分泌平衡调控,其机制主要通过TRPV4通道实现。

张力敏感性阳离子通道在气道黏液基础分泌中的介导作用

目的探讨节律性压力波维持气道黏蛋白(MUC)基础性分泌的主要信号节点。方法采用气/液相界面法培养人气道上皮16HBE细胞,模拟正常呼吸所产生的节律性压力波作用于培养细胞,分为静态对照组、节律性压力波组、节律性压力波+张力敏感性阳离子通道(TRPV4)拮抗剂钌红、节律性压力波+维拉帕米、节律性压力波+蛋白激酶C抑制剂(GF109203x)共5组,通过激光共聚焦观察Ca2+浓度变化,RT-PCR检测TRPV4mRNA表达,West-ern bolt检测MARCKS及SNAP-23水平,ELISA检测MUC(2、5AC和5B)分泌情况。结果节律性压力波组胞内Ca2+浓度(312.34±17.08)和TRPV4 mRNA(0.63±0.03)较静态对照组(196.16±35.06,0.28±0.05)显著增高(P<0.01),RR干预后明显降低(P<0.01);同时MUC(2、5AC和5B)分泌,pMARCKS及pSNAP-23蛋白水平明显增高(P<0.01),给予Ca2+及PKC抑制剂预处理后,上述各指标蛋白均降低(P<0.01)。结论 TRPV4参与节律性压力波维持气道上皮基础性MUC分泌平衡,此过程籍以激活Ca2+/PKC/MARCKS信号通路实现。

重组融合蛋白BoNT-LH(N)-Elafin在毕赤酵母中的表达及其活性

目的利用毕赤酵母表达系统表达BoNT-LH(N)-Elafin融合蛋白,并检测其生物学活性。方法构建pPIC9K-BoNT-LH(N)-Elafin重组真核表达质粒,转化毕赤酵母GS115菌株,甲醇诱导表达,取上清,经阳离子交换层析纯化融合蛋白,并检测其反应原性、抗弹性蛋白酶活性及对SNARE蛋白复合体的裂解作用。结果重组表达质粒pPIC9K-BoNT-LH(N)-Elafin经双酶切及测序证实构建正确;表达的BoNT-LH(N)-Elafin融合蛋白相对分子质量约为110 000,纯化的融合蛋白纯度达92%,浓度为54 mg/L,反应原性良好,具有抗弹性蛋白酶活性及裂解SNARE蛋白复合体的作用。结论已在毕赤酵母GS115中成功表达了重组融合蛋白BoNT-LH(N)-Elafin,该融合蛋白具有良好的生物学活性,为进一步研究其抑制气道黏液高分泌的机制奠定了基础。