KDR siRNA表达载体的构建和鉴定

目的构建针对血管内皮生长因子受体Ⅱ(VEGFR2),又称激酶功能区受体(KDR)的pSilencerTM3.1siRNA(smallinterferingRNA)表达载体,并在前列腺癌细胞PC3中观察其干扰效果.方法设计针对KDR基因编码区的寡核苷酸链,体外退火后克隆入经BamHⅠ,HindⅢ双酶切线性化的干扰载体pSilencerTM3.1-H1neo中,对重组质粒进行酶切分析和DNA系列测定.以脂质体法将pSilencerTM3.1-H1neo空载体和3个(pSilencer3.1-KDR1,pSilencer3.1-KDR2和pSilencer3.1-KDR3)重组质粒分别导人PC3前列腺癌细胞系.72h后用RT-PCR和Westernblotting技术检测各实验组前列腺癌细胞内KDRmRNA及蛋白水平的表达情况.结果经酶切鉴定及DNA测序,重组质粒中已插入了目的基因片断.转染KDR-siRNA的前列腺癌细胞,72h后,而以pSilencer3.1-KDR3的抑制KDRmRNA及蛋白表达效果最为有效,其抑制率约为55%.结论成功构建了针对KDR的RNA干扰表达载体pSilencer3.1-KDR1,pSilencer3.1-KDR2和pSilencer3.1-KDR3,pSilencer3.1-KDR3能有效抑制KDR在前列腺癌细胞中表达,为将其进一步应用于前列腺癌的治疗研究奠定了基础.

血管内皮生长因子及其受体KDR在前列腺癌细胞中的表达研究

目的：探讨血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受体(KDR)在前列腺癌细胞中的表达及意义。方法：免疫细胞化学和Western blot检测体外培养的LNCaP,PC-3,PC-3M,DU-145和22RV1前列腺癌细胞中VEGF及其受体KDR的蛋白表达,RT-PCR检测mRNA,ELISA检测前列腺癌细胞培养上清VEGF蛋白含量。结果：免疫细胞化学染色显示VEGF和KDR在前列腺癌细胞LNCaP,PC-3,PC-3M,DU-145和22RV1中均有表达,但表达水平略有差别。LNCaP,PC-3和DU-145细胞中VEGF和KDR蛋白表达及其mRNA的含量显著高于PC-3M和22RV1(P<0．01)。细胞培养上清中VEGF蛋白含量结果与免疫细胞化学染色结果相同。结论：VEGF及其受体KDR在前列腺癌细胞中的表达量不近相同,但二者的表达对研究前列腺癌的发生发展及其机理有重要意义。

用RNAi沉默survivin基因表达对前列腺癌细胞系PC3的影响

目的:运用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术阻断前列腺癌细胞系PC3中survivin基因的表达,并研究 survivin基因沉默后对PC3细胞产生的影响。方法:用真核转录载体pSilencerTM3．1-H1 neo构建针对survivin基因的重组真核转录载体pSilencer 3．1-SVV1、pSilencer 3．1-SVV2和pSilencer 3．1-SVV3,并用脂质体法转染前列腺癌细胞系PC3,通过RT- PCR、蛋白印迹实验检测sunrivin的表达变化,并用流式细胞术、MTT法检测转染后PC3细胞的凋亡、细胞周期、细胞生长速度、对顺铂的敏感性等芳面的变化。结果:重组载体pSilencer 3．1-SVV2和pSilencer 3．1-SVV3有效地阻断了PC3细胞中sur- vivin基因在mRNA和蛋白水平上的表达(P<0．01)。重组载体转染PC3细胞后,与对照组相比,细胞的凋亡增加了10％- 15％;细胞生长速度明显变慢,其细胞数在84 h时与对照组相比减少约30％;G1期细胞增加了10％,G2期和S期细胞减少了 5％以上。加入顺铂后,pSilencer 3．1-SVV2、pSilencer 3．1-SVV3重组质粒转染的PC3细胞的存活数下降了35％-45％,细胞凋亡则增加了10％-14％。结论:初步证明了survivin基因在前列腺癌细胞分化增殖、抗凋亡等方面所扮演的重要角色,为进一步阐明survivin基因与前列腺癌的关系以及以survivin基因为靶点的前列腺癌基因治疗研究奠定了基础。

应用RNA干扰技术阻断PC-3细胞中survivin基因的表达

目的：用真核转录载体pSilencer^TM3.1-H1 neo构建针对survivin基因的重组真核转录载体,并转染前列腺癌细胞系PC-3,通过RNA干扰（RNAi）阻断PC-3细胞中survivin基因的表达,并研究survivin基因沉默后对PC-3细胞凋亡产生的影响.方法：将合成的DNA正义链及反义链变性、退火,形成的双链DNA与pSilencer^TM3.1-H1 neo线性质粒用T4DNA连接酶连接,重组质粒经酶切及DNA测序鉴定后,用脂质体法转染PC-3细胞,通过RT-PCR、免疫印迹和免疫组织化学染色实验检测survivin的表达变化,并用流式细胞术检测转染后PC-3细胞的凋亡变化,MTr法检测细胞生长速度的变化.结果：酶切及测序证实设计合成的DNA已正确插入载体.RT-PCR、免疫印迹和免疫组织化学染色实验表明,pSilencer3.1-SVV2和pSilencer3.1-SVV3重组载体有效地阻断了PC-3细胞中survivin基因的表达,survivin基因在mRNA和蛋白水平上的表达明显下调（P＜0.01）,转染后PC-3细胞的凋亡增加了10%～15%,细胞生长速度明显变慢.结论：成功构建了针对survivin基因的真核转录载体pSilencer3.1-SVV1、pSilencer3.1-SVV2和pSilencer3.1-SVV3,后两者可有效地阻断前列腺癌细胞系PC-3细胞中survivin基因的表达,并使转染后PC-3细胞的凋亡增加了10%～15%,细胞生长速度明显变慢.

凋亡抑制蛋白Survivin在前列腺癌细胞系中的表达

目的:研究凋亡抑制蛋白survivin在前列腺癌细胞系PC-3、PC-3M、DU145、LNCaP和22RV1中的表达水平。方法:应用免疫细胞化学技术,免疫印迹技术及RT-PCR技术检测5种前列腺癌细胞系中凋亡抑制蛋白survivin的表达。结果:免疫细胞化学染色结果显示,各前列腺癌细胞系survivin阳性细胞百分率,PC-3为23%,DU145为18%,LNCaP为15%,22RV1、PC-3M分别为11%和12%。免疫细胞化学染色阳性分值,PC-3为49.42+4.71,PC-3M为28.45+6.82,DU145为34.27+6.08,LNCaP为34.09+5.22,22RV1为31.66+7.13。与其他细胞系相比以PC-3细胞系中survivin的表达量最高(F=22.84,P<0.01)。Western blot结果显示,PC-3、LNCaP、DU145细胞系中的survivin蛋白总量相对较高,而22RV1、PC-3M中的survivin蛋白总量相对较低,RT-PCR结果显示,PC-3、LNCaP细胞中的survivin mRNA水平相对较高。结论:5种前列腺癌细胞系中均有survivin的表达但表达水平略有差别。研究前列腺癌细胞系中凋亡抑制蛋白survivin的表达对研究前列腺癌的发生、抗药性机制及新药物靶位的筛选具有重要意义。

前列腺癌细胞株VEGF及其受体KDR,bFGF及其受体FGFR2的表达及意义

目的:探讨人前列腺癌细胞株血管内皮细胞生长因子(VEGF)及其受体(KDR),碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及其受体(FGFR2)的表达,进一步阐明前列腺癌细胞中VEGF和bFGF的自分泌机制。方法:以小鼠成纤维细胞系L929作为对照,选取三种前列腺癌细胞株(PC3、LNcap和DU145),采用免疫组化染色、RT-PCR及Westernblot,检测VEGF及其受体KDR,bFGF及其受体FGFR2的表达。结果:三种前列腺癌细胞株(PC3、LNcap和DU145)中均有VEGF、KDR及bFGF、FGFR2的表达,但表达水平略有差别。结论:在前列腺癌的血管形成中可能存在VEGF和bFGF的自分泌机制。

RNAi介导的survivin基因沉默对PC-3细胞裸鼠体内成瘤能力的影响

目的:研究survivin基因表达沉默后对PC-3细胞的裸鼠体内成瘤率,瘤体生长速度,以及平均瘤重等方面产生的影响。方法:使用RNA干涉技术,用构建的pSilencer 3.1-SVV1、pSilencer 3.1-SVV2、pSilenc-er3.1-SVV3 siRNA表达质粒和阴性对照质粒pSilencer3.1-NC转染PC-3细胞,使PC-3细胞的survivin基因表达沉默,随后将细胞接种于裸鼠皮下,观察转染了各质粒的PC-3细胞在裸鼠体内成瘤率,瘤体生长速度,以及平均瘤重等方面的变化。结果:pSilencer 3.1-SVV2和pSilencer 3.1-SVV3质粒转染组的裸鼠肿瘤成瘤率明显下降,裸鼠瘤体生长速度明显慢于未转染组和pSilencer 3.1-NC质粒转染组(P<0.01)。实验终止时,肿瘤平均体积与瘤重与未转染组和pSilencer 3.1-NC质粒转染组相比减少50%-55%。结论:RNAi介导的survivin基因沉默可显著影响PC-3细胞裸鼠体内成瘤能力及瘤体生长速度。

速率法测定酶活性线性范围的分析与设定

酶法测定都有线性范围规定,如果标本酶活性过高,超过线性范围,则需要对标本稀释重做,然后乘以稀释倍数.我们在实践操作中发现,有些标本虽然超过线性范围,但反应进程曲线显示仪器仍能对其准确测定,而不需要对标本进行稀释重做.

沉默激酶功能区受体抑制前列腺癌PC-3细胞的裸鼠体内成瘤能力

目的研究激酶功能区受体(KDR)基因表达沉默后对前列腺癌PC-3细胞裸鼠体内成瘤能力的影响。方法将15只5周龄BALB/c雄性裸鼠随机分为干扰组、阴性质粒组和未转染组,每组5只。分别接种构建的pSilencer 3.1-KDR siRNA表达质粒转染PC-3细胞、阴性对照质粒pSilencer3.1-NC转染PC-3细胞以及未转染的PC-3细胞于裸鼠皮下;观察各组PC-3细胞在裸鼠体内成瘤率、瘤体生长速度以及平均瘤质量等方面的变化,RT-PCR和Western blot技术检测瘤体KDR基因和蛋白表达。结果pSilencer3.1KDR质粒转染组的裸鼠瘤体生长速度明显慢于未转染组和pSilencer3.1-NC质粒转染组;与未转染组和PSilencer3.1-NC组相比,pSilencer3.1-KDR组肿瘤的生长受到明显抑制,平均体积较小(0.28 cm3vs 0.721 cm3,0.715 cm3,P<0.01),平均瘤质量较轻(0.14 g vs 0.648 g,0.635 g,P<0.01);裸鼠肿瘤组织中KDR mRNA和蛋白的表达明显降低。结论 RNAi介导的KDR基因沉默可显著影响PC-3细胞裸鼠体内的瘤体生长速度,KDR有可能成为肿瘤治疗的新靶点。

细胞周期蛋白E2在人鼻咽癌组织中的表达及临床意义

目的:研究细胞周期蛋白E2(Cyclin E2)在人鼻咽癌(NPC)组织中的表达及临床意义。方法:应用免疫组织化学法和RT-PCR法检测NPC组织及鼻咽非肿瘤组织Cyclin E2蛋白和mRNA的表达。结果:Cyclin E2蛋白在NPC和鼻咽非肿瘤组织中的表达率分别为75%(45/60)和9.5%(2/21),两者相比有统计学意义(P<0.01);鼻咽癌组织中Cyclin E2蛋白的过表达对同年龄、性别的患者无统计学差异(P>0.05),但与淋巴结转移、分期和5年生存率有相关性(P<0.01)。鼻咽癌组与对照组相比,Cyclin E2 mRNA表达亦有统计学差异(P<0.01)。结论:Cyclin E2表达对判断鼻咽癌病变进展、生存率及转移有重要参考价值。

中华链球菌引起感染性心内膜炎1例

中华链球菌(Streptococcus sinensis)是链球菌的Mitis类群成员,因发现地为中国香港,所以称之为中华链球菌。该菌于2002年由Woo等[1]首次从1例慢性风湿性心脏病患者体内分离出,并证实可引起感染性心内膜炎(infective endocarditis,IE)。笔者从1例IE患者的血培养标本中分离出中华链球菌,结合文献复习,报告如下。

侵蚀艾肯菌致糖尿病足感染1例

侵蚀艾肯菌为革兰阴性兼性厌氧菌,属于人类黏膜表面正常菌群,通常不致病,只形成带菌状态[1]。当机体免疫力下降或黏膜破损时侵入周围组织引起感染,并可引发远处组织和器官化脓性感染,严重感染者可危及生命[2]。本例为糖尿病足患者的脓性分泌物中检出侵蚀艾肯菌,现报道如下。

siRNA沉默PC3细胞中KDR基因的表达

目的:构建针对血管内皮生长因子受体Ⅱ(KDR)基因的shRNA表达载体,研究KDR基因沉默后对PC3细胞的增殖、生长的影响.方法:将合成的三对DNA正义链及反义链变性、退火,形成的双链DNA与pSilencerTM3.1-H1neo线性质粒用T4DNA连接酶连接,构建pSilencer3.1-KDR1,pSi-lencer3.1-KDR2和Psilencer3.1-KDR3三个siRNA表达载体.经酶切及DNA测序鉴定后,采用脂质体介导的基因法转染PC3细胞,通过RT-PCR、免疫印迹和免疫细胞化学染色实验,检测KDR的表达变化,MTT法检测细胞生长速度的变化,流式细胞仪检测细胞周期的变化,以未转染和转染阴性对照质粒pSilencer3.1-NC的PC3细胞为对照.结果:酶切及测序证实设计合成的DNA已正确插入载体.RT-PCR、免疫印迹和免疫细胞化学染色实验表明,pSilencer3.1-KDR3有效地降解了PC3细胞中KDR基因的mRNA,下调蛋白表达;转染pSilenc-er3.1-KDR3后PC3细胞生长速度明显变慢.结果表明,pSi-lencer3.1-KDR3组PC3细胞的G0/G1期百分率明显增高,而S期和G2M期的细胞减少,与其余组相比差异具有统计学意义(P<0.01).而pSilencer3.1-KDR1和pSilencer3.1-KDR2无效.结论:成功构建针对KDR基因的siRNA表达载体,只有pSilencer3.1-KDR3可有效地沉默KDR在前列腺癌细胞系PC3细胞中的表达,抑制PC3细胞的增殖.

PhaB和FQ-PCR两种快速检测结核分枝杆菌方法的比较

目的比较裂解型分枝杆菌噬菌体检测技术(Phage amplified biologically assay,PhaB)和荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)快速检测临床标本中结核分枝杆菌的优缺点及临床应用价值。方法对142例肺结核患者的痰标本和41份非结核性痰标本应用PhaB法和FQ-PCR进行检测和结果比较。结果PhaB法阳性76例,阳性率53.5%;FQ-PCR法阳性84例,阳性率59.1%。PhaB法和FQ-PCR法相比,有统计学差异(P<0.05)。2种方法检测41份非结核性痰标本均为阴性。结论两种方法能快速、简便、灵敏、特异检测结核分枝杆菌,同时又有不同的特点。

乌司他丁对胃癌细胞生物学功能的影响

目的探讨乌司他丁与胃癌细胞MKN-45增殖、凋亡、侵袭的关系以及可能的作用机制。方法采用不同浓度的乌司他丁(400 U/ml、800 U/ml、1 600 U/ml)作用于体外培养的MKN-45细胞中,分为对照组、400 U/ml组、800 U/ml组、1 600 U/ml组;MTT实验检测乌司他丁对细胞增殖的影响,流式细胞术检测细胞的凋亡率,Transwell小室法检测细胞侵袭能力的变化,采用免疫印迹法(Western blotting)检测核因子κB(NF-κB)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)水平。结果与对照组相比,乌司他丁显著抑制细胞的增殖(P<0.05),促进其凋亡(P<0.05),降低细胞的侵袭能力(P<0.05)。800 U/ml组与400 U/ml组比较,差异有统计学意义(P<0.05),但与1 600 U/ml组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。乌司他丁显著抑制NF-κB、Bcl-2蛋白水平(P<0.05),显著增加Bax蛋白水平(P<0.05);且随着浓度的增加,抑制作用逐渐增强(P<0.05)。结论乌司他丁可以抑制胃癌细胞的增殖,促进其凋亡,降低细胞的侵袭能力,其作用机制与NF-κB信号通路相关。

Actinotignum schaalii血流感染1例及病原体鉴定报告

Actinotignum schaalii是一种新型致病菌,可导致尿路感染和侵袭性感染。2022年贵黔国际总医院收治1例急性尿潴留患者血培养标本,采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术鉴定结果为Actinotignum schaalii,为兼性厌氧的革兰阳性球杆菌。该病例为国内首次血培养检出Actinotignum schaalii,该患者使用头孢他啶5 d后,感染症状明显减轻,感染指标恢复正常,患者未诉发热等不适,遂出院。结合国内外相关文献,探讨Actinotignum schaalii的临床特征、鉴定及治疗。

类干酪乳杆菌引起的导管相关性血流感染1例

类干酪乳杆菌又叫副干酪乳杆菌,是一种无芽孢、不运动的兼性厌氧或厌氧革兰氏阳性杆菌,其作为重要的益生菌,具有免疫调节、拮抗致病菌、抗突变和防癌等益生性质[1]。通常可以从人体口腔、阴道及肠道中分离出来。类干酪乳杆菌能调节人体肠道菌群,增强免疫力,还有一定的抑菌性[2];雷虹等[3]发现类干酪乳杆菌能产生抑菌物质抑制革兰氏阳性、阴性菌及多种致病菌生长。由类干酪乳杆菌导致的感染鲜见报道,本研究检出1例由类干酪乳杆菌引起的导管相关性血流感染,现报道如下。

ROSCO纸片法与ATBFUNGUS3微量稀释法抗真菌药敏试验结果对比分析

近年来,真菌感染已成为白血病,淋巴瘤,长期使用免疫抑制、广谱抗生素,中心静脉插管,中性粒细胞减少,血液透析,骨髓或器官移植,机械通气等特殊人群的严重感染性疾病,是医院内感染的重要部分,抗真菌药物的广泛应用导致真菌的耐药率逐年上升，病原性酵母菌的药敏试验已显得极其重要。