白血病细胞系来源的树突状细胞诱导及其抗肿瘤免疫功能研究

树突状细胞 (DC)在抗肿瘤免疫反应中起关键作用 ,但大多数白血病病人有DC功能缺陷。在体外扩增DC并增强其抗肿瘤免疫功能及以DC为基础的肿瘤疫苗是对白血病有效的免疫治疗方法。为了探讨由不同的髓性白血病细胞系诱生DC的条件及其抗白血病反应 ,选用HL 6 0 ,K5 6 2和THP 1细胞与不同的细胞因子组合诱生DC ,以光学和电子显微镜术观察形态特征 ,用流式细胞术和单克隆抗体检测细胞表型 ,以同种混合淋巴细胞反应观察刺激淋巴细胞增殖 ,用51Cr释放法检测诱生细胞的细胞毒作用 ,用ELISA法测定DC培养及DC +血单个核细胞联合培养的血清中IL 12及IFN γ的量。结果表明 ,由K5 6 2 ,HL 6 0和THP 1细胞诱生的DC具有树突状细胞的形态学特征 ,细胞表达DC的表面分化抗原 ,其中GM CSF +IL 4 +TNF γ刺激HL 6 0 DC和THP 1 DC和GM CSF +IL 4 +IL 12刺激的K5 6 2 DC中有抗原表达。 3种细胞诱生的DC对混合淋巴细胞反应及CTL反应有强刺激作用。诱生DC的培养上清和DC与血单个核细胞共培养上清中分别测出不同量的IL 12和IFN γ。结论提示 ,细胞因子能诱导髓性白血病细胞产生DC ,不同细胞需要不同的细胞因子和培养条件。这些DC表达抗原呈递细胞的表型具有刺激T淋巴细胞增殖和诱导CTL反应以及分泌IL 12和促进T细胞分泌IFN γ的?

神经节苷脂GD2可作为肺癌干细胞一个潜在的候选标志物

目的探索神经节苷脂GD2作为肺癌干细胞(LCSCs)标志物的可行性。方法用成球培养的方式在体外富集肺癌细胞系的肿瘤干细胞(CSCs);用实时定量PCR和蛋白质免疫印迹法检测LCSCs中干性相关基因以及GD3合成酶(GD3S)的表达;用流式细胞测量术检测肺腺癌细胞系A549中GD2及其他干性表型的表达;用CCK8法检测细胞增殖;用Transwell小室法和细胞划痕愈合实验检测细胞的体外侵袭和迁移;用肺癌移植瘤模型比较细胞系A549中不同亚群的致瘤性。结果体外成球培养能够成功富集到A549细胞的肿瘤干细胞,贴壁培养时,GD2+细胞的比例为0.57%,成球培养后GD2+细胞比例能够上升至20.4%。与GD2-A549细胞相比,GD2+A549细胞的体外增殖(P<0.05)、侵袭(P<0.05)和迁移能力(P<0.01)均显著提高。GD2与另外两种肺癌干细胞表型之间有密切联系,其表达水平与CD44(P<0.01)及EpCAM(P<0.001)的表达呈正相关。体内的结果表明,相比于GD2-A549细胞,接种GD2+A549细胞后肿瘤生长更快(P<0.001),恶性程度更高(P<0.01)。结论神经节苷脂GD2可作为LCSCs的潜在标志物以识别肿瘤干细胞,将GD2作为肺癌免疫治疗的靶点提供了新的思路。

慢性粒细胞白血病来源的DC细胞体外诱导高效而特异的抗肿瘤免疫

目的：选用慢粒患者的原代血细胞，经细胞因子组合联合诱导，生成携带白血病抗原信息的树突状细胞（Ｄｅｎｄｒｉ－ｔｉｃ Ｃｅｌｌ ， ＤＣ），为ＤＣ疗法在临床上的应用提供理论依据。方法：慢粒（急变期）病人的ＰＢＭＣ用ＧＭ－ＣＳＦ＋ＩＬ－４＋ＴＮＦα诱导后进行形态和细胞表型的鉴定。应用同种混合淋巴细胞反应和细胞毒性实验，观察诱生之ＤＣ刺激淋巴细胞增殖的能力以及介导抗白血病特异性细胞毒性反应的能力。利用酶联免疫吸附实验检测ＤＣ产生ＩＬ－１２及协助产生ＩＦＮ－γ的能力。结果： 诱生ＤＣ均具有ＤＣ的形态特征和超微结构。表达ＤＣ相关表面分化抗原。并可刺激Ｔ淋巴细胞产生较强的增殖效应。诱导出针对自身肿瘤靶细胞的特异性ＣＴＬ反应。同时可不同程度的分泌ＩＬ－１２和可协助Ｔ细胞产生ＩＦＮ－γ。结论： 慢粒细胞在适当的细胞因子的诱导下，可分化为具有ＤＣ形态的细胞，后者可诱导出高效而特异的抗肿瘤免疫。

T淋巴细胞克隆技术

T淋巴细胞是一类具有多种功能的细胞群,过去一般认为成熟的T细胞可分为三大亚群,即杀伤性T细胞(T_c),辅助性T细胞(T_H)和抑制性T细胞(T_s),它们分别执行各自的功能.T细胞的功能具有多样性,而每一亚类细胞都在免疫应答中具有特殊的效应,长期以来,对于T细胞在免疫应答中所发挥的作用还不是完全清楚,过去由于缺乏获得纯T细胞功能亚群的方法,从而阻碍了进一步分析各类细胞在免疫应答中的特异功能.

造血生长因子受体的信号传导与血液系统恶性疾病

造血生长因子 (hematopoieticgrowthfactor,HGF)属细胞因子类 ,是一类具有广泛生物学活性的可溶性多肽 ,对血细胞的生长、增殖、分化具有调控作用 ,它与其受体结合后可通过作用于多种信号转导途径并激活转录因子 ,从而达到调节细胞生长、分化的作用。造血生长因子受体及信号传导一直是当前研究的热点问题。大多数的造血生长因子是通过JAKs STATs和Ras途径进行信号传导 ,表现相应的生理功能。目前发现上述途径的异常活化与多种血液系统恶性肿瘤的发生有密切关系。

人外周血树突状细胞的体外培养扩增

目的： 在体外从人外周血中培养扩增树突状细胞。方法：从正常人外周血分离PBMC，经两次孵育粘附，弃去悬浮细胞后加细胞因子（GM-CSF，IL-4）和培养液进行培养，并对培养过程进行观察鉴定。结果：培养1周后即可培养出典型的树突状细胞，经FITC-CD1a单抗标记后用流式细胞仪检测DC的CD1a表达率为 65%，并能刺激同种淋巴细胞增殖反应。结论：利用GM-CSF和 IL-4可以从人外周血中扩增出大量DC，可为后续研究做准备。

人脐血来源的树突状细胞的体外培养扩增

目的 于体外从人脐血中培养扩增树突状细胞。方法 从剖腹产胎盘中抽取脐血 ,分离单个核细胞 ,按程序加入细胞因子组合 (SCF +GM CSF +IL 4 +TNF α)进行培养及相应的鉴定。结果 培养至 6～ 7d即出现较为典型的DC ,15d培养周期结束后 ,经流式细胞仪检测 ,所得的细胞中 ,CD1a的表达率为 18.5 3% ,并表达功能相关分子CD4 0、CD86、MHCⅡ DR ,能刺激同种T细增殖。结论 利用细胞因子组合可以从脐血单个核细胞中诱导出DC 。

三种中药皂甙对K_(562)细胞诱导分化作用的实验研究

目的研究人参总皂甙（ＴＳＰＧ）、绞股蓝总皂甙（ＧＰ）、三七总皂甙（ＰＮＳ）对Ｋ５６２细胞诱导分化的影响；方法采用细胞体外培养技术，通过细胞形态学、细胞化学、表面膜抗原（ＨＩＲ２、ＣＤ１５、ＣＤＷ４１）等检测方法；结果经三种皂甙诱导后，ＴＳＰＧ、ＧＰ不能诱导Ｋ５６２细胞合成过氧化物酶（ＰＯＸ）而能合成血红蛋白（Ｈｂ），仅有表达ＣＤＷ４１，ＨＩＲ２的阳性细胞数明显增加；而ＰＮＳ不能诱导Ｋ５６２细胞合成Ｈｂ而能合成ＰＯＸ，表达ＣＤＷ４１、ＨＩＲ２、ＣＤ１５的阳性细胞数均明显增加；结论ＴＳＰＧ、ＧＰ、ＰＮＳ均能诱导Ｋ５６２细胞向多系分化为较成熟的细胞，ＴＳＰＧ、ＧＰ主要诱导其向红系分化。

肿瘤微环境中乳酸对巨噬细胞表型极化和功能的影响

目的研究肿瘤微环境中乳酸对巨噬细胞表型极化和功能的影响。方法在Balb/c小鼠乳腺处接种乳腺癌细胞4T1,研磨肿瘤组织后测其乳酸浓度。以不同浓度乳酸处理RAW264.7巨噬细胞,用流式细胞术、RT-PCR和Western blot检测M1、M2型巨噬细胞的标志分子和NFκB P50/P65。蛋白芯片检测RAW细胞分泌的细胞因子。流式细胞术检测RAW细胞吞噬功能和抗原递呈功能。结果小鼠乳腺癌组织的乳酸浓度高于正常乳腺组织(P<0.05)。15 mmol/L浓度的乳酸可显著上调RAW细胞M2型标志分子的表达(P<0.05),下调M1标志分子的表达(P<0.05),使RAW细胞分泌的M1型细胞因子明显减少(P<0.05),同时使磷酸化NFκB P65降低(P<0.05)。乳酸对RAW细胞的吞噬功能没有明显的影响,但减弱其抗原递呈功能(P<0.05)。结论在乳酸的作用下,RAW巨噬细胞表型向M2型转变,抗原递呈功能减弱,NFκB参与调控乳酸对巨噬细胞的作用。提示肿瘤微环境中的乳酸对抗肿瘤免疫有较大影响。

靶向激活蛋白激酶PKR对白血病K562细胞增殖的影响及机制

背景与目的:由t(9;22)(q34;q11)导致的bcr-abl融合基因在慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)发病中起着重要的作用。本研究运用CML特异的bcr/abl融合基因的mRNA与外源重组反义RNA形成双链RNA(double strand RNA,dsRNA)能激活双链RNA依赖性蛋白激酶(double-stranded RNA-dependent protein kinase,PKR)的策略,研究其对白血病K562细胞增殖的影响及可能的机制。方法:将dsRNA类似物聚肌苷酸-聚胞啶酸(Polyriboinosinic Polyribocytidylic Acid,polyIC)、含bcr/abl融合基因序列40bp的逆转录病毒载体RV-40AS、RV-40AS+2-氨基嘌呤(2-aminopurine,2AP)和含绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的逆转录病毒载体RV-GFP作用于K562细胞,并以ECV304细胞作对照细胞株。通过细胞计数、MTT法和半固体集落形成实验检测其对细胞生长增殖的影响,用流式细胞仪检测处理前后细胞周期的变化,用Western blot法检测细胞内PKR、磷酸化PKR(phosphated PKR,p-PKR)、真核翻译启始因子2α(eukaryotic initiation factor-2α,eIF2α)、磷酸化eIF2α(phosphated eIF2α,peIF2α)蛋白表达的变化,用3H-亮氨酸掺入实验检测细胞总蛋白合成水平的变化。结果:polyIC对K562细胞和ECV304细胞生长和增殖均具有非特异性抑制作用,而RV-40AS仅对K562细胞具有特异性的抑制效应。PKR抑制剂能阻断RV-40AS对K562细胞的抑制效应。polyIC和RV-40AS作用K562细胞24h后,S期细胞减少[polyIC组(37.26±2.35)%,未处理组(58.53±5.42)%,P<0.05;RV-40AS组(31.48±3.65)%,未处理组(58.53±5.42)%,P<0.05],G0/G1期细胞增多[polyIC组(50.97±2.18)%,未处理组(36.44±4.20)%,P<0.05;RV-40AS组(57.47±3.61)%,未处理组(36.44±4.20)%,P<0.05]。polyIC处理K562细胞组、ECV304细胞组以及RV-40AS处理K562细胞组的p-PKR和p-eIF2α蛋白表达显著上调,且总蛋白合成水平下降[RV-40AS处理的K562细胞组(3.5±1.9)cpm/ng,未处理组(26.8±2.6)cpm/ng,P<0.05]。结论:外源重组反义RNA与bcr/abl融合基因的mRNA形成的dsRNA可通过激活PKR而抑制K562细胞的生长增殖,其机制是通过活化的PKR使蛋白合成启始因子eIF2α磷酸化,从而阻断细胞内蛋白合成的启动,及阻止细胞周期进程来实现。

芦丁复合物对兔实验性脑梗塞血浆中TXB_2、6－Keto－PGF_（1α）的影响

通过建立兔大脑中动脉阻塞局灶性脑缺血实验模型，测定缺血后及经芦丁复合物治疗后血浆中ＴＸＢ_２、６－Ｋｅｔｏ－ＰＧＦ_（１α）含量。结果发现ＴＸＢ_２在脑梗塞后明显增高，而６－Ｋｅｔｏ－ＰＧＦ_（１α）含量降低，经芦丁复合物治疗后ＴＸＢ_２减少，６－Ｋｅｔｏ－ＰＧＦ_（１α）增高，与缺血组比较有显著性差异（Ｐ＜０．０ｌ）。提示芦丁复合物有明显的调节ＴＸＢ_２／６－Ｋｅｔｏ－ＴＧＦ_（１α）平衡，减轻缺血性脑损伤的作用。

慢性炎症对肿瘤干细胞的调控

大量研究已证实肿瘤干细胞是肿瘤耐药、复发和转移的根源.慢性炎症与肿瘤的发生和发展密切相关,肿瘤炎性微环境中的IL-6、IL-8、EGF等炎性因子和生长因子激活了肿瘤干细胞内NF-κB/Stat3信号通路,维持肿瘤干细胞的自我更新能力,从而促进肿瘤的生长和转移.深入研究肿瘤炎性微环境对肿瘤干细胞的调控机制,可以使我们找到潜在的治疗靶点,为攻克肿瘤带来新的思路和手段.

重组逆转录病毒双表达载体的构建及其对K562细胞增殖活性的影响

目的构建针对慢性粒细胞白血病bcr-abl b3a2型mRNA的双表达逆转录病毒载体,初步探讨其对K562细胞表型的影响。方法以逆转录病毒载体pMSCV-neo为骨架,构建eGFP及针对bcr-abl b3a2型mRNA的反义RNA双表达载体pMSCV/GFP-H1-BCR/ABL40AS,同时构建对照载体pMSCV/GFP-H1-BCR/ABL40S和pMSCV/GFP-H1-BCR/ABL80AS,酶切及测序鉴定各重组载体;以脂质体法转染各载体到PT67包装细胞后,G418筛选稳定的病毒产生细胞株,再以NIH3T3细胞测定病毒滴度并感染K562细胞,计数细胞数绘制细胞生长曲线,FCM检测细胞凋亡情况、并用Westernblot检测PKR激活情况。结果酶切及测序结果证实各重组载体构建完全正确;G418筛选到高滴度重组逆转录病毒生产细胞株:PT67-MSCV/GFP、PT67-40as、PT67-40s和PT67-80as,且PT67-40as上清感染组K562细胞生长受抑制,其24h时早期细胞凋亡率为22.54±3.19%,与除PT67-80as组外的其余各组相比有显著差异(P<0.05);PT67-40as和PT67-80as处理组细胞PKR磷酸化水平分别增高了59.20%和60.33%,2AP能抑制PT67-40as的作用。结论成功构建重组逆转录病毒双表达载体,并发现其能抑制K562细胞生长并引起细胞凋亡,通过激活PKR抗肿瘤可望成为肿瘤新的靶向治疗策略。

健康人外周血树突状细胞的体外培养扩增及其CDla等表面分子的表达分析

树突状细胞(DC)是一种功能最强的抗原提呈细胞,其最显著的特征是能够刺激初始型T细胞增殖,而B细胞和巨噬细胞只能刺激记忆型或被活化的T细胞,因此DC在免疫应答诱导中起重要作用.

B7转染白血病细胞K562的作用研究

目的：探讨共刺激信号分子Ｂ７转化人白血病细胞株Ｋ５６２后，转化细胞的生物学性状变化及介导的免疫作用。方法：构建重组真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３．１Ｂ７，转化人白血病细胞株Ｋ５６２，获得单个细胞克隆，观察Ｋ５６２－Ｂ７的生长周期，绘制生长曲线，检测Ｋ５６２－Ｂ７诱导Ｔ细胞分泌ＩＬ－２的情况。结果：ｐｃＤＮＡ３．１Ｂ７可在Ｋ５６２中稳定表达，Ｋ５６２－Ｂ７的生长增殖速度比野生型Ｋ５６２慢。在体外，Ｋ５６２－Ｂ７可诱导ＰＭＮＣ分泌ＩＬ－２，２４ｈ上清液中ＩＬ－２含量比Ｂ７阴性Ｋ５６２高１倍左右。结论：Ｂ７基因转入人白血病细胞株Ｋ５６２后，细胞本身增殖能力降低，且Ｋ５６２—Ｂ７可活化ＣＤ＋４Ｔ细胞分泌细胞因子ＩＬ－２，提高宿主抗肿瘤免疫能力。

B7修饰K562细胞来源的树突状细胞抗肿瘤作用的研究

目的 探讨共刺激信号分子B7转化人白血病细胞株K562后,K562-B7在细胞因子作用下分化为树突状细胞(Dendritic cell,DC),K562-B7-DC的生物学特性以及介导的抗肿瘤免疫作用。方法 构建重组真核表达质粒pcDNA3.1D7转化人白血病细胞株K562,获得单个细胞克隆。用K562-B7细胞株在GM-CSF、IL-4和IL-12的联合作用下分化为DC细胞,观察K562-B7-DC的生物学性质及其抗肿瘤的免疫功能。结果 K562-B7-DC在GM-CSF、IL-4和IL-12的联合作用下能分化为DC细胞并能诱导出较强的同种混合淋巴细胞反应及CTL活性,且能分泌内源性IL-12、INF-γ。结论 细胞因子联合诱生的K562-B7-DC能有效的执行其抗原提呈功能,同时协同T淋巴细胞发挥其抗肿瘤免疫作用。

血浆纤维结合蛋白的免疫散射比浊测定法

血浆纤维结合蛋白(Fibronectin Fn)含量测定在其方法上国内已有单向免疫扩散法、火箭免疫电泳法,和酶联免疫吸附试验法.由于前两种方法的敏感性较差不适用于Fn含量较低的样品,虽然酶联免疫吸附试验敏感性较高.但由于需血浆量较多、费时、操作复杂等缺点,故我们采用免疫散射比浊法进行测定.该法利用测定溶液中悬浮质点的散射光强度的原理,因此与荧光比色法有相似之处。

增强凋亡的哺乳动物新型线粒体蛋白质—Smac/Diablo

细胞凋亡的调节因素众多 ,近年来线粒体相关因素越来越受到重视。本文介绍一种新型线粒体蛋白质—Smac/Diablo在凋亡的线粒体途径中诱导凋亡的作用及相关机制。这为诱导肿瘤细胞凋亡及抗肿瘤治疗提供有益的借鉴。