猪流行性腹泻病毒N蛋白阻断ELISA抗体检测方法的建立及初步应用

旨在建立一种猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白阻断ELISA抗体检测方法。本研究将纯化的N蛋白作为包被抗原,通过棋盘滴定法优化ELISA反应条件,建立了检测PEDV抗体的阻断ELISA方法,并对其进行特异性、敏感性和重复性试验。对140份临床血清样品进行检测,并将检测结果与市售IDvet PEDV间接ELISA抗体检测试剂盒试剂盒进行比较。结果显示,建立的阻断ELISA方法的抗原最佳包被浓度为625 ng·mL^(-1),血清最佳稀释比例为1∶1;酶标抗体的最佳工作浓度为1∶5000;检测健康猪血清以及猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和传染性胃肠炎病毒(TGEV)等常见猪病病原的阳性血清,均无交叉反应;PEDV阳性血清的灵敏度为1∶16,与市售IDvet PEDV间接ELISA抗体检测试剂盒(效价1∶32)的敏感性相当;批内、批间重复性试验的变异系数均小于10%,说明具有良好的重复性和稳定性;对140份临床血清样品的检测并与商品化试剂盒检测结果进行比较,两者的kappa值为0.87,为高度一致。综上表明,本研究建立的阻断ELISA抗体检测方法可以应用于PEDV的防控、流行病学调查以及疫苗免疫后抗体水平的监测。

非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的阻断ELISA方法,本研究利用原核表达的ASFV p30重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体。以重组p30蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的p30单克隆抗体作为检测抗体,经条件优化,建立了一种检测ASFV抗体的阻断ELISA方法。ROC曲线分析显示,该方法最佳阻断率临界值为16.63%。该方法与CSFV、FMDV-O/A、PRRSV、PEDV、SVA的阳性血清均无交叉反应;最低能检出1∶128稀释的阳性血清;批内和批间变异系数(CV)均<10%。用本方法与商品化试剂盒平行检测208份血清样品,Kappa值为0.96,表明具有高度一致性。上述结果表明,本研究建立的阻断ELISA方法具有较高的特异性和敏感性,可用于血清ASFV抗体的检测,为ASFV流行病学调查及猪群疫情监控提供技术支持。

猪瘟病毒化学发光抗体检测方法的建立与应用

旨在建立猪瘟病毒(CSFV)化学发光抗体检测方法,本研究以CSFV E2蛋白作为包被抗原,山羊抗猪IgG-HRP抗体作为酶标抗体,鲁米诺为底物溶液,优化检测方法,成功建立CSFV化学发光抗体检测方法。该方法能在室温20 min内完成对CSFV抗体血清特异性检测,灵敏度与商品化CSFV抗体检测试剂盒相当,且与A型口蹄疫病毒、O型口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、塞内卡病毒、非洲猪瘟病毒抗体阳性血清均无交叉反应;批内变异系数为1.80%~6.88%,批间变异系数为1.11%~9.18%,重复性好。通过对152份田间猪血清样品的检测并与商品化CSFV抗体检测试剂盒检测结果进行比较,其Kappa值为0.929,具有高度的一致性。综上表明,本研究建立的CSFV化学发光抗体检测方法特异性强、灵敏性高、重复性好、简单快速,可应用于临床血清CSFV抗体的检测。

ELISA试剂盒法和HPLC法检测大麦中呕吐毒素的比较

摘要：目的：通过比较两种方法对呕吐毒素的检测结果，验证呕吐毒素ELISA试剂盒快速检测法的准确性。方法：大麦样品经过不同的前处理提取后分别进行ELISA和HPLC检测，并进行加标回收试验。结果：试验在0-800μg／kg加标浓度范围内，ELISA试剂盒法和HPLC法检测结果接近，平均回收率分别为91．9％和83．7％，变异系数（RSD）均低于10％。结论：相对于HPLC法，呕吐毒素ELISA试剂盒法操作简单快捷、检测时间短，灵敏度高、稳定性好，适用于大批量大麦样品中呕吐毒素含量的定量快速筛选。

抗非洲猪瘟病毒单链抗体的构建、表达及活性鉴定

制备抗非洲猪瘟病毒(ASFV)猪源单链抗体(ScFv),并对其生物学活性进行鉴定,筛选出具有ASFV反应活性的猪源单链抗体(ScFv),为ASFV的诊断提供新的材料。采集ASFV感染康复猪的外周血,分离淋巴细胞,提取淋巴细胞总RNA,以此为模板通过PCR扩增得到猪源IgG重链可变区与轻链可变区基因,利用SOE-PCR技术扩增拼接得到猪源ScFv基因;构建pET-30a-ScFv表达载体,进行蛋白的表达与纯化,用ELISA和IFA鉴定ScFv抗体的反应活性。结果显示,成功扩增出猪源ScFv(VH-VLκ、VH-VLλ)基因,鉴定到1株与ASFV存在反应活性的ScFv(VH-VLλ_(11))抗体。结果表明,成功筛选到1株与ASFV存在反应活性的ScFv(VH-VLλ_(11))抗体,为ASFV诊断和防控提供了新型原材料。

快速水分测定仪法在鸡精水分检测中的应用

通过比较国标烘箱法和快速水分测定仪法对鸡精水分的检测结果,验证快速水分测定仪法在应用上的准确性。方法:鸡精样品经粉碎后分别采用国标烘箱法和快速水分测定仪进行水分检测,通过结果对比确定了快速水分测定仪的最佳设定温度。结果:快速水分测定仪法重复性好,RSD小于2%;快速水分测定仪设置检测温度为80℃时测定结果与烘箱法对应性较好,相对误差小于3%。结论:相对于传统烘箱法,快速水分测定仪法测量结果可靠,同时提高了检测速度、简化了操作步骤,适用于生产过程中对鸡精水分进行快速检测。

赤羽病病毒N蛋白原核表达及单克隆抗体的制备

为制备赤羽病病毒(akabane virus,AKAV) N蛋白的单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb),本研究利用原核表达系统表达了AKAV N蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合获得杂交瘤细胞,采用间接酶联免疫吸附方法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)筛选获得阳性杂交瘤细胞。经3次亚克隆筛选得到两株特异性针对AKAV N蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为2C9与5E9。通过ELISA、免疫印迹(Western blotting)、间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay,IFA)对其进行鉴定。结果显示,成功筛选到特异性针对AKAV N蛋白的单克隆抗体。IFA发现其与AKAV N蛋白具有良好的反应性,亚型鉴定试剂盒鉴定2C9 mAb重链为IgG2b型,轻链为κ链;5E9 mAb重链为IgG1型,轻链为κ链;ELISA检测效价均为1:4 096 000。本研究成功制备了两株特异性针对AKAV N蛋白的单克隆抗体,为赤羽病诊断方法的开发、疾病的防控以及AKAV N蛋白功能的研究奠定了基础。

犬冠状病毒诊断技术研究进展

犬冠状病毒(canine coronavirus,CCoV)属于套式病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)、α冠状病毒属成员。近几年,冠状病毒感染犬的比例正在不断上升,加上有研究表明犬也会感染新型冠状病毒,而市场上缺少治疗冠状病毒的特效药物。因此,快速、精确的诊断宠物疫病对该病的防控起到不可或缺的作用。目前,犬冠状病毒常用的检测技术分为临床诊断、病原学检查和血清学检查,但由于冠状病毒病的流行病学特点、临床症状以及病理剖检缺乏特征性变化,据此只能作出初步诊断,病原学检查主要分为病毒分离培养、电镜诊断、PCR、RPA、夹心ELISA和RT-RAA;血清学检查主要分为中和试验、间接ELISA、胶体金免疫层析试纸条。2019年新型冠状病毒感染导致的疫情在全球爆发以来,备受社会各界关注,一些新的变异毒株也在不断出现。因此,亟需一种快速、简便、成本低、灵敏性高、特异性强的诊断方法来监测、预警疫情,为进一步研发特异性疫苗提供参考与帮助。

猪瘟病毒抗体胶体金免疫层析试纸条的研制及初步应用

为建立一种简便、快捷、特异、敏感的猪瘟病毒(CSFV)E2抗体的胶体金检测方法,本研究将E2蛋白用胶体金颗粒标记,作为金标抗原,将E2蛋白及其单克隆抗体包被在硝酸纤维素膜(NC)上,分别作为检测线(T线)和质控线(C线),组装成检测猪瘟E2蛋白抗体的胶体金免疫层析试纸条。结果显示,该试纸条可在5~10 min完成检测,检测健康猪血清、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、口蹄疫A型病毒(FMDV-A)、口蹄疫O型病毒(FMDV-O)、塞内卡病毒(SVA)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、非洲猪瘟病毒(ASFV)的阳性血清均无交叉反应;检测CSFV阳性血清的灵敏度可达1∶64(ELISA效价为1∶128);通过对田间101份猪血清样品进行检测,并与商品化猪瘟病毒抗体检测试剂盒的检测结果比较,两者的kappa值为0.92,为高度一致;试纸条在常温(18~25℃)和4℃条件下可分别稳定保存6个月和9个月。上述结果表明,本研究制备的试纸条具有较高的敏感性和特异性,且具有检测快速、操作简便、结果容易判断等特点,因此,对猪瘟现场检测有实际应用价值。

A型塞内卡病毒的病毒样颗粒的制备及其免疫原性分析

为了研制A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)的病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)疫苗,以SVA田间流行毒株CH-FJ-2017结构蛋白基因序列为研究对象,构建了能够同时表达SVA的3种结构蛋白VP0、VP1和VP3的单个原核重组表达质粒pET28a-SVA-VP031。通过大肠杆菌Escherichia coli表达、亲和层析纯化和体外自组装,获得SVA VLPs。透射电子显微镜鉴定显示,SVA的3种结构蛋白在体外能够自组装成直径约25–30 nm的VLPs,并且动物免疫试验结果表明,该VLPs能够有效刺激豚鼠产生高水平的抗原特异性中和抗体。上述研究结果为SVA VLPs疫苗的研制奠定了基础。