基于CRISPR/Cas9系统构建青鳉突变体

青鳉是研究基因功能、器官发生和发育机制的模式生物之一,基因编辑技术已在青鳉中得到广泛应用,但利用CRISPR/Cas9技术构建青鳉突变体的详细过程还未见报道。为了完整详细地阐明青鳉突变体的构建过程,实验以青鳉Olpax6.1基因的敲除为例,首先利用ChopChop网站设计获得Olpax6.1基因gRNA的靶点;其次通过PCR扩增和质粒酶切分别获得gRNA和Cas9 mRNA体外转录的模板,并通过体外转录合成gRNA和Cas9 mRNA;再将Cas9 mRNA和gRNA混合进行青鳉胚胎显微注射获得突变F_(0);最后利用PCR、T7EndonucleaseⅠ酶切和Sanger测序筛选F_(0)与野生型杂交的子代获得相同突变类型的F_(1),进而将相同突变的F_(1)进行杂交并筛选其子代,获得青鳉Olpax6.1敲除的纯合突变体,纯合突变体表现出眼部发育畸形的经典表型。本研究为青鳉突变体的构建提供详细完整的实验方案,同时也为其他鱼类突变体的构建提供技术参考。

青鳉抗病毒感染过程的负调控因子jun的鉴定

Jun(Jun proto-oncogene,AP-1 transcription factor subunit)为组成转录因子AP-1的亚单位或亚家族成员,参与机体的免疫应答。为了进一步了解jun基因在鱼类抗病毒天然免疫方面的功能,以日本青鳉为研究对象,采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术获得jun缺失的纯合子突变体品系,并对其在神经坏死病毒(nervous necrosis virus,NNV)感染过程中的特征展开研究。基因克隆结果显示,野生型日本青鳉的jun基因编码区全长921 bp,共编码306个氨基酸,含有N端的Jun超家族结构域和C端的bZIP超家族结构域,并在眼、脑、鳃、心脏、头肾、卵巢、精巢、肝脏、脾脏9个检测的组织中均有较高的表达。突变体jun-/-在基因组减少了124 bp,而蛋白只剩下59个氨基酸的N端序列,缺失了Jun超家族结构域和bZIP结构域。病毒感染实验结果显示,jun-/-仔鱼对于神经坏死病毒(nervous necrosis virus,NNV)的耐受能力相对野生型仔鱼有所提升;jun-/-成鱼眼、脑、鳃和肌肉组织内的病毒相对含量都显著低于野生型。进一步的qRT-PCR结果显示,在jun-/-青鳉中,fosl1的表达极显著下调,tbk1的表达降低,而irf3的表达极显著上调。以上结果表明,jun缺失能增强青鳉耐受NNV病毒的能力,jun基因可能是一个青鳉抗病毒信号通路的负调控因子。

一种可高效转染的青鳉肌肉细胞系的建立与应用（英文）

在哺乳动物细胞系中转基因的效率相对较高而在鱼类细胞系中相对较低,为了获得鱼类高效转基因细胞系,我们从模式鱼类青鳉(Oryzias latipes)中分离和构建了肌肉细胞系OLM。该细胞系类似于纤维细胞,在28℃DMEM和10%的胚胎牛血清中培养了超过88代。通过染色体分析,它属于两倍体并含有48条染色体。在脂质体介导下,报告基因的转染效率可以达到40%,在测试的其他鱼类细胞中转染效率最高。此外还构建了稳定转染转基因或者非编码RNA的细胞系。OLM细胞对常见的病毒SVCV、GCRV、SGIV等不敏感。综上所述,研究在青鳉中建立了一种能高效转染的肌肉细胞系,它适用于鱼类瞬时和稳定的转基因研究。

青鱼Dazl基因的原核表达及其多克隆抗体制备

实验进行了青鱼( Mylopharyngodon piceus ) Dazl 基因的原核表达,兔抗青鱼源Dazl多克隆抗体的制备及抗体的特异性验证。首先将青鱼 Dazl 基因的编码区利用重组表达引物从pCS2- MpDazl 质粒中扩增出来,经酶切后连接到pET-28a载体中,构建pET-28a- MpDazl 重组表达载体。然后将pET-28a- MpDazl 重组质粒转化至大肠杆菌( Escherichia coli )BL21中,利用异丙基-β-d-硫代半乳糖苷( IPTG)诱导表达,获得分子量为27 kD的Dazl重组蛋白。将纯化的Dazl重组蛋白作为抗原免疫家兔制备多克隆抗体,抗体的效价和特异性通过ELISA法和 Western blot检测。结果:成功构建重组表达载体pET-28a- MpDazl;以0.5 mmol/L IPTG在37 ℃条件下诱导4 h可获得高效表达的Dazl重组蛋白;制备的兔抗青鱼Dazl多克隆抗体能够特异性识别原核表达Dazl蛋白、青鱼卵巢的内源Dazl蛋白以及细胞中过表达的Dazl蛋白,并证实了青鱼Dazl蛋白在性腺中表达的特异性。