RP-HPLC法测定川菊中芦丁的含量

建立一种四川菊花中芦丁含量测定的反相高效液相色谱法。以Vensusil BP C18（4.6mm×250mm）为色谱柱,以MeOH-0.5%H3PO4（v：v=40：60）为流动相,流速：1.0mL/min,柱温：30℃。采用紫外检测器检测目标组分,检测波长：245nm。实验验结果表明芦丁在2μg/mL-200.0μg/mL范围内有良好的响应关系,其R^2值为0.9994,平均加标回收率在91.0%-96%之间,相对标准偏差在2.2%-4.5%之间。该方法针对性强、简便、灵敏,可为四川菊花的开发利用提供可靠的检测方法。

外源性NO对脂肪干细胞成软骨分化的影响

目的通过观察不同浓度外源性一氧化氮(nitric oxide,NO)供体硝普钠(SNP)对脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)增殖状况及相关基因表达的影响,探讨外源性NO在ADSCs成软骨分化中的作用。方法获取并培养ADSCs,分别进行成骨和成脂诱导,采用茜素红染色和油红O染色进行多向分化鉴定。NO检测试剂盒检测ADSCs成软骨分化过程中NO的变化;采用细胞计数试剂盒-8(CCK8)法检测不同浓度SNP(0.25mmol/L、1.00mmol/L、4.00mmol/L)下ADSCs的增殖情况。以Real time-PCR(RT-PCR)方法检测ADSCs在不同浓度SNP下,表达转化生长因子-β1(TGF-β1)以及成软骨分化特异基因——信号传导蛋白Smad3、Ⅱ胶原蛋白(Col-Ⅱα1)基因的变化。结果培养的细胞经成骨和成脂诱导后茜素红染色和油红O染色呈阳性;ADSCs成软骨分化过程中,培养上清液中NO浓度始终比对照组高(P<0.05);与对照组相比,低浓度SNP(0.25mmol/L、1.00mmol/L)对ADSCs的增殖无明显影响(P>0.05),高浓度SNP(4.00mmol/L)抑制ADSCs增殖,差异有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR检测发现SNP能抑制ADSCs自身TGF-β1mRNA的表达,同时抑制Smad3mRNA和Col-Ⅱα1mRNA的表达。结论在ADSCs成软骨分化过程中,外源性NO可以通过抑制ADSCs自身产生TGF-β1,并且抑制TGF-β下游信号通路,从而抑制成软骨分化。

大鼠β-catenin miRNA表达载体的构建及在脂肪干细胞中沉默效果的检测

目的构建具有沉默大鼠脂肪干细胞β-catenin表达的miRNA(miR)表达载体。方法通过酶切法将合成的miR表达载体寡聚核苷酸引物与质粒pSWH相连,形成pSWH-miR;PCR扩增出增强型绿色荧光蛋白(EGFP)开放阅读框,插入经双酶切处理的pSWH-miR形成pSWH-EGFP-miR。β-catenin miR表达质粒瞬时转染SD大鼠脂肪干细胞(adipose-derived stem cells derived from rats,rADSCs),72h后提取细胞全蛋白,Western blot检测β-catenin的表达情况。结果针对大鼠β-catenin的不同位点,一共构建了5个miRNA表达载体(miR-780、miR-796、miR-1467、miR-1948、miR-1960),其中miR-780、miR-796对β-catenin沉默效果最好(P<0.05),miR-1960的沉默效果次之(P<0.05),miR-1467、miR-1948不具有沉默效果(P<0.05)。结论 miR-780、miR-796能够有效沉默SD大鼠脂肪干细胞中β-catenin的表达。