猴痘自组装纳米颗粒候选疫苗的制备及免疫应答特征研究

目的 本研究旨在制备自组装纳米颗粒猴痘候选疫苗并研究其免疫应答特征,为其疫苗设计提供可参考的试验数据。方法 利用原核系统表达纯化抗原蛋白A29L-SpyTag和骨架蛋白Mi3-SpyCatcher,化学组装制备纳米颗粒A29L-Mi3,皮下免疫小鼠,通过ELISA测定抗体效价、空斑试验测定抗体中和、流式细胞术测定淋巴细胞分泌细胞因子情况,并描述其免疫应答特征。结果 成功制备A29L-Mi3纳米颗粒,颗粒呈中空笼状均匀分布,其粒径平均为(29±0.19) nm。A29L-Mi3纳米颗粒候选疫苗联合SP01佐剂后,中和抗体效价强于A29L蛋白候选疫苗,且A29L-Mi3纳米颗粒候选疫苗免疫2次即能够获得免疫3次相近滴度的中和抗体。A29L-Mi3纳米颗粒候选疫苗激活的小鼠T淋巴细胞免疫应答水平高于A29L蛋白候选疫苗。结论 成功体外组装制备出结构均一的A29L-Mi3蛋白纳米颗粒,具有较强的免疫原性,联合SP01佐剂后中和能力提高,为免疫程序的优化提供参考数据。细胞免疫应答水平均高于单独的A29L蛋白,为猴痘疫苗的设计与研发提供借鉴。

布氏杆菌PBP_(39)蛋白抗原表达及免疫效果的研究

目的 获得纯化的布氏杆菌PBP3 9重组蛋白抗原,观察PBP3 9重组蛋白的免疫原性。方法 扩增不同种布氏杆菌PBP3 9基因,测序、连接表达载体PET3 2a ,诱导表达,柱纯化PBP3 9重组蛋白抗原,免疫BALB/c小鼠,ELISA检测抗体及抗体亚型。结果 我国牛、羊、猪布氏杆菌PBP3 9基因与国外已报道的PBP3 9编码基因不完全相同。在蛋白N端5 8位碱基后多一G ,造成移码突变。故在85、86、87位编码终止子TCA。而在13 4、13 5、13 6位的ATG又编码了新的起始密码。布氏杆菌PBP3 9蛋白在大肠杆菌高效表达,表达量达40 % ,纯化重组蛋白抗原免疫BALB/c小鼠,产生了较高水平的特异性抗体免疫应答,抗体亚型主要是IgG1。结论 我国牛、羊、猪布氏杆菌PBP3 9编码抗原蛋白同国外已报道的不完全相同,纯化的PBP3 9重组蛋白抗原可诱导高水平的抗体反应,为筛选布氏杆菌病新型疫苗保护性抗原分子奠定了基础。

布氏杆菌病新型疫苗的研究进展

布氏杆菌病是一种流行广泛、危害很大的人畜共患病。因其独特的致病机制及感染后难以根治的特点,疫苗的应用一直是其主要的防治方法。其疫苗的应用也大体经历了死苗、减毒活疫苗、菌体组分苗等发展历程,但各种疫苗的有效性及对机体的毒性一直是应用的难点和隐患。随着科技的发展,基因疫苗等各种新型疫苗的发现又为布氏杆菌疫苗的研究开辟了新天地,已成为疫苗研究的热点及重点。本文就布氏杆菌病新型疫苗的研究现状与进展等方面做一综述。

布氏杆菌pCDNA3.1-L7L12核酸疫苗的构建及其免疫学评价

目的 获得布氏杆菌保护性抗原L7 L12重组蛋白及pCDNA3.1 L7 L12重组质粒 ,并比较其诱导特异性免疫应答的能力。方法 PCR扩增布氏杆菌核蛋白L7 L12基因分别构建至原核表达载体PET32a(+)和真核表达载体pCDNA3.1(+)中 ;pET32a L7 L12重组质粒转化BL2 1(DE3) ,所表达蛋白经SDS PAGE、免疫印迹分析、纯化后免疫小鼠 ;pCDNA3.1 L7 L12重组质粒配以GM CSF同时肌肉注射免疫小鼠 ,3次免疫后测定免疫功能进行免疫效果的评价。结果 ELISA、Westernblot检测到免疫鼠体内有特异性抗体产生 ,蛋白苗所诱导的抗体效价远远高于DNA疫苗 ;通过淋巴细胞增殖实验、细胞因子和CD分子测定表明DNA疫苗以诱发TH1 型免疫为主。结论 所构建的布氏杆菌DNA疫苗和蛋白苗均具有诱导特异性细胞和体液免疫应答的能力 ,DNA疫苗诱导产生的细胞免疫反应强于蛋白苗 ,可作为潜在的布氏菌新型疫苗 。

羊种布鲁氏菌疫苗株M5和强毒株16M的比较蛋白质组学研究

目的阐明羊种布鲁氏菌疫苗株M5致弱的分子基础,更加深入地理解布鲁氏菌的毒力机制。方法利用双向电泳技术对相同条件下培养的羊种布鲁氏菌疫苗株M5和强毒株16M总蛋白进行分离,两株间差异蛋白点利用基质辅助激光解吸/电离串联飞行时间质谱技术进行鉴定。每个蛋白质点的肽指纹图谱均使用Mascot在NCBInr蛋白质数据库中进行检索。结果共成功鉴定了13个差异蛋白,代表了8种不同的开放阅读框(ORFs),功能涉及能量代谢,应激,物质运输等。结论上述发现为羊种布鲁氏菌疫苗株M5致弱分子基础的阐明提供了新依据。

鼠疫F1-V融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达及鉴定

目的通过构建pET-11c-F1-V融合表达质粒,从而获得具有免疫原性的融合蛋白。方法克隆鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)的F1基因和V基因,然后将F1基因和V基因分别连接到pGEM-T载体上,经测序正确后再将F1基因和V基因连接到pET-11c原核表达载体上,构建pET-11c-F1-V融合表达质粒,并转化到BL21(DE3)大肠杆菌中,进行PCR及双酶切鉴定,筛选阳性克隆,通过IPTG诱导F1-V表达,经SDS-PAGE检测表达产物,通过Western-Blot检测重组蛋白的免疫原性。结果测序结果显示F1基因的碱基序列与Gene-bank(X 61996)完全一致,V基因的碱基序列与Gene-bank(M 26405)相比在564 bp处有一同义突变;SDS-PAGE在Mr约58 000处出现一条蛋白条带,经薄层扫描分析目的蛋白条带约占全菌体蛋白的25％左右,主要以可溶性蛋白形式存在;Western-Blot显示重组蛋白具有免疫原性。结论成功地构建了pET-11c-F1-V融合表达质粒,并且在大肠杆菌中获得了高效表达,表达的蛋白具有免疫原性。

布鲁氏菌外膜蛋白免疫蛋白质组学方法的建立

目的建立布鲁氏菌外膜蛋白的免疫蛋白质组学研究方法,筛选布鲁氏菌保护性抗原。方法利用双向电泳技术对实验条件下培养的布鲁氏菌疫苗株M5外膜蛋白进行分离,结合WB(Western blotting)技术寻找发生免疫反应的蛋白质。结果21个免疫蛋白点经胶内酶切、肽提取后用基质辅助激光解析/电子飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行鉴定。每个蛋白点的肽质量指纹图谱用Mascot进行检索后,代表了12个开放阅读框。这些蛋白不全是外膜蛋白,还存在胞浆蛋白,其功能涉及生物合成和物质代谢等领域,还有一个功能未知的蛋白。结论成功建立了布鲁氏菌外膜蛋白的免疫蛋白质组学研究方法,为寻找保护性抗原及为新型疫苗抗原候选提供新思路。

布氏杆菌BCSP_(31)/pVAX1重组表达质粒的构建及其免疫保护效果的研究

目的构建布氏杆菌BCSP31/pVAX1重组表达质粒,免疫BALB/c小鼠,观察其免疫应答及免疫保护效果。方法克隆BCSP31基因,构建BCSP31/pVAX1重组表达质粒。转染COS7细胞,免疫组化检测其BCSP31蛋白抗原的表达。BCSP31/pVAX1重组表达质粒肌肉注射免疫BALB/c小鼠,观察特异性体液免疫和细胞免疫效果。进一步用1.25×104布氏杆菌A544强毒株腹腔攻毒,观察BCSP31/pVAX1重组表达质粒的免疫保护效果。结果扩增的BCSP31保护性抗原基因片断在牛、羊和猪布氏杆菌株中具有高度保守性,构建的BCSP31/pVAX1重组表达质粒在COS7细胞有目的蛋白抗原的表达。制备的BCSP31/pVAX1重组表达质粒肌肉免疫BALB/c小鼠4次,ELISA检测BCSP31/pVAX1重组表达质粒产生了较高水平的特异性IgG抗体,并随免疫次数增加抗体的滴度也递增,且抗体亚型以IgG2a为主,表明主要引起Th1型的免疫应答。FCM检测BCSP31/pVAX1重组表达质粒的CD4+/CD8+比值明显下降,说明激发了显著的CTL效应。MTT测定BCSP31/pVAX1重组表达质粒的淋巴细胞增殖能力与对照组比较差异显著。布氏杆菌A544强毒株攻毒后,动物存活及脾组织细菌数与对照组比较有显著性差异,说明BCSP31/pVAX1重组表达质粒能够产生有效的保护效果。结论研制的BCSP31/pVAX1重组表达质粒免疫BALB/c小鼠能产生高水平的特异性体液免疫和细胞免疫,以细胞免疫为主,并产生有效的免疫保护效果,为布氏杆菌病新型疫苗的研究奠定了基础。

以减毒沙门菌为载体布鲁氏菌DNA疫苗的构建及免疫原性分析

目的构建携带布鲁氏菌BLS-L7/L12融合基因的重组减毒沙门菌并进行免疫原性分析,为口服布鲁氏菌DNA疫苗研究奠定基础。方法将BLS-7/L12融合基因克隆到真核表达载体asd+-pVAX1,依次将重组质粒转化减毒沙门菌X3730、X4550得到重组沙门菌X4550(asd+-pVAX1-BLS-L7/L12)。以1×109CFU/只的剂量口服免疫Balb/C小鼠,3次免疫后进行免疫效果的评价。结果构建的重组减毒沙门菌质粒转染COS-7细胞经免疫组化和Western-blot试验证明BLS-L7/L12融合蛋白在细胞中得到了瞬时表达,ELISA检测到免疫小鼠血清和肠黏液中有特异性抗体IgG和sIgA产生。通过淋巴细胞增殖实验、细胞因子和CD分子测定表明DNA疫苗以诱发Th1型免疫为主。结论所构建的以重组沙门菌为载体口服布鲁氏菌DNA疫苗具有诱导特异性细胞免疫和体液免疫应答的能力,且以细胞免疫应答为主。可作为潜在的布鲁氏菌新型疫苗。

鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原的制备及其免疫保护效果的研究

为制备鼠疫耶尔森氏菌F1-V重组融合蛋白抗原,观察其免疫原性和免疫保护效果,通过疏水层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析纯化鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原.用氢氧化铝凝胶吸附制备试验性鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原,皮下接种健康BALB/c小鼠,ELISA检测血清F1-V抗体效价、MTT法测定淋巴细胞增殖能力,进一步用400LD50鼠疫耶尔森氏菌141标准毒株皮下攻毒,观察动物的存活情况.通过三步柱层析纯化获得的鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原纯度达到90%以上.氢氧化铝凝胶吸附的鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原免疫BALB/c小鼠三次,血清抗F1-V抗体效价为1∶(51200±800),对耶尔森氏菌141强毒株攻击的保护率是90%.上述结果表明,制备的鼠疫F1-V重组融合蛋白抗原具有良好的免疫原性和免疫保护效果,为研制鼠疫F1-V重组融合蛋白疫苗奠定了基础.

布鲁杆菌基因工程疫苗免疫保护效率的初步观察

目的比较布鲁杆菌6种抗原表位所获得的基因工程疫苗的免疫保护效率。方法布鲁杆菌核糖体蛋白L7/L12、胞质蛋白P39、细胞表面蛋白BCSP31、二氧四氢喋啶合成酶BLS、16.5×103的外膜蛋白PAL和翻译起始因子IF3的基因片段与真核表达载体pcDNA3.1(+)构建的核酸疫苗及上述6条片段转入pET32a(+)后诱导表达的的重组蛋白免疫小鼠,3次免疫后进行攻毒实验,对其免疫保护效率进行初步观察。结果L7/L12和BLS的重组蛋白疫苗和核酸疫苗都产生了非常显著的保护作用,P39的核酸疫苗、IF3和BCSP31的重组蛋白疫苗也产生了非常显著的保护作用,其中L7/L12核酸疫苗的保护效率最高。结论初步认为布鲁杆菌的优势抗原表位所获得的基因工程疫苗可产生一定的抗布鲁杆菌作用,可作为未来布鲁杆菌新型疫苗的候选者,有进一步研究的价值。

2006～2007年流行流感病毒减毒疫苗株的构建(英文)

选择冷适应、温度敏感、减毒的A/Ann Arbor/6/60(H2N2)流感病毒株作为骨架病毒,对其6个内部基因片段进行了全基因合成,同时人工引入5个氨基酸突变(PB1-391E,581G,661T,PB2-265S,NP-34G).HA和NA来源于2006～2007当年流行株A/New Caledonia/20/99(H1N1).8个基因片段通过与改造后的转录载体pAD3000连接,构建8个基因的拯救载体,经测序获得序列准确的拯救质粒:pMDV-A-PB2、pMDV-A-PB1、pMDV-A-PA、pMDV-A-NP、pMDV-A-M、pMDV-A-NS、pMDV-A-HA、pMDV-A-NA.6质粒与当年流行株的表面基因HA和NA进行"6+2"组合的病毒拯救,8个重组质粒共转染COS-1细胞,成功拯救出了具有血凝性的冷适应减毒的重组A型人流感病毒.鸡胚尿囊液中重组病毒的血凝效价为1∶29～1∶210.构建的A/AA/6/606个内部基因的病毒骨架拯救系统,为深入研究冷适应减毒人流感病毒的基因功能和新型疫苗研发奠定了基础.

DNA免疫激发针对肾母细胞瘤CTL效应初步研究

目的将鼠源肾母细胞瘤WT1基因一段序列(WT1y)构建于真核表达质粒pCDNA3.1(+),通过小鼠和体外细胞模型初步研究所激发的针对肾母细胞瘤CTL效应。方法人工合成WT1基因一段序列,含有HLA-A*2402锚定残基的9个氨基酸。构建重组真核表达质粒pCDNA3.1(+)/WT1y。免疫Balb/c小鼠,通过ELISA方法检测体液免疫反应;分离脾淋巴细胞,FCM检测脾淋巴细胞中CD4/CD8;将分离的脾淋巴细胞与小鼠肾母细胞瘤细胞共培养,检测其体外溶解组织相容性抗原型别一致的外源性靶细胞能力。结果构建的重组质粒经测序鉴定,与GenBank中登录的序列完全一致;免疫组小鼠T淋巴细胞增殖及CTL活性均明显优于对照组(P<0.01);体外具有较强溶解靶细胞的功能。结论WT1基因的DNA疫苗初步研究具有很强的CTL效应,为小儿肾母细胞瘤的治疗提供了新的思路。

中和性马抗体对SARS-CoV感染的防治作用

目的探讨马抗SARSCoV中和性抗体是否对SARSCoV感染有防治作用。方法用SARSCoV(BJ01株)免疫马匹,从免疫马血清中制备IgGs及其F(ab’)2片段。通过细胞病变法(CPE)、MTT法和空斑形成实验(PFU)等方法,在体外培养的VeroE6细胞中检测F(ab’)2片段对SARSCoV感染的预防性和治疗性作用。再在Balb/c小鼠体内模型中,用CPE法和定量RTPCR方法检测该抗体的保护性效应。结果CPE、MTT和PFU三种方法证实来自三匹马的血清F(ab’)2的中和滴度均达到1∶1600以上。体内实验证实,50μg的F(ab’)2片段可以完全中和1×104TCID50SARSCoV。结论马抗SARSCoV抗体在体内外均能有效地中和SARSCoV和预防其感染宿主细胞,为马抗体将来在大的灵长类动物或人体内进行实验提供实验依据。

鼠疫菌重组质粒pcDNATE/F1-V的构建及其免疫效果的研究

目的获得含有鼠疫F1和V抗原编码基因的重组质粒pcDNATE/F1-V,并测定其诱导特异性免疫应答的能力。方法PCR扩增鼠疫菌F1和V编码基因,分别与pGEM-T连接测序,构建pcDNATE/F1-V融合重组质粒,转染COS-7细胞,用Westernblot方法鉴定目的蛋白的表达,重组质粒pcDNATE/F1-V加集落刺激因子(GM-CSF)免疫Balb/c小鼠,观察免疫效果。结果pcDNATE/F1-V在COS-7细胞中表达,免疫鼠体内产生特异性抗体,抗体亚型分析、细胞因子等指标的测定结果表明所构建DNA疫苗以诱发Th1型免疫为主。结论成功构建重组真核表达质粒pcDNATE/F1-V,其具有诱导特异性细胞免疫和体液免疫应答的能力,为鼠疫菌新型疫苗研制奠定了基础。

冷适应减毒B型流感病毒疫苗候选株的制备及鉴定(英文)

以冷适应、温度敏感、减毒的B/Ann Arbor/1/66流感病毒株作为重配病毒骨架,对其6个内部基因片段进行了全基因合成,同时人工引入9个氨基酸突变.构建了8个基因的拯救载体,经测序获得序列准确的拯救质粒,命名为:pAB121-PB1,pAB122-PB2,pAB123-PA,pAB124-HA,pAB125-NP,pAB126-NA,pAB127-M和pAB128-NS.在成功拯救冷适应A型流感病毒的基础上,利用反向遗传学技术成功获救了具有感染性的重配B型流感病毒株,命名为rMDV-B.该重配病毒株以B/Ann Arbor/1/66为病毒骨架,其中HA和NA来源于2006～2007年当年流行株B/Malaysia/2506/2004.rMDV-B在鸡胚尿囊液和MDCK细胞中的HA效价可达1∶64～1∶512.实验结果暗示:从单一供体病毒株可以产生有效的减毒活B型流感病毒疫苗候选株,能够为将来人用流感疫苗的设计提供可借鉴的模型.

从cDNA感染性克隆产生冷适应重配A型人流感病毒及免疫原性的初步研究

目的从cDNA感染性克隆产生冷适应重配A型人流感病毒株,并对其生物学特性和免疫原性进行初步测定。方法采用RT-PCR技术,分别扩增2006至2007年疫苗株A/New Caledonia/20/99的HA、NA全长基因片段,构建转录表达双向载体pMDV-A-HA、pMDV-A-NA,将这2个质粒与冷适应拯救系统的6个质粒共转染COS-1细胞,并对拯救的重配病毒的生物学特性和免疫原性进行初步鉴定。结果拯救出具有冷适应表型和温度敏感型的A型人流感弱毒株,初步测定了重配病毒的生物学特性和免疫原性。结论成功拯救具有冷适应和温度敏感表型的A型人流感弱毒株,并初步测定其免疫原性,为我国弱毒疫苗株的拯救和弱毒疫苗的发展奠定了基础。

A/California/07／2009亚型猪流感冷适应减毒疫苗株的拯救及免疫效果评价

应用反向遗传学技术,选择冷适应、温度敏感、减毒的A/Ann Arbor/6/60 ca(H2N2)型流感病毒的6个内部基因为骨架,与A/California/07/2009株流感病毒2个抗原基因HA、NA分别克隆到polⅠ-polⅡ转录表达载体pAD3000中,构建8个转录表达载体重组质粒,共转染Vero细胞,获得重配A/California/07/2009ca株流感病毒.重配病毒的TCID50为7.5,病毒传4代后其血凝素(HA)滴度稳定在1∶256,半数感染剂量EID50为8,鸡胚传20代,经RT-PCR鉴定未发现重组病毒基因突变,电镜观察重配病毒符合流感病毒的主要特征;蔗糖纯化的病毒经肌肉注射(灭活)及滴鼻(减毒活病毒)两种途径免疫BALB/c小鼠,结果显示:滴鼻免疫和肌肉注射都可以产生较高效价的血凝抑制(HI)抗体,肌肉注射组产生的HI抗体略高(P=0.044),但肌肉注射组检测不到高效价IgA抗体;滴鼻免疫组鼻冲洗液中可以检测到高效价的IgA抗体,同型病毒感染后,IL-1β、TNFα、IFN-α等前炎因子分泌较早,且高于肌肉注射组(P<0.05),可见,喷鼻减毒疫苗比灭活全病毒疫苗能更好地激发黏膜免疫反应.通过对小鼠各个器官病毒载量的检测发现,4天后鼻腔、气管、脑、肺、脾脏没有病毒存在,证明减毒活疫苗株在小鼠上是安全的.以上数据可以初步断定,重组病毒有作疫苗候选株的可能,而且喷鼻疫苗具有降低免疫剂量、同时激活体内体液免疫和细胞免疫的功能.

用反向遗传技术产生冷适应致弱的重组A型人流感病毒的研究

目的以鸡胚高度适应株A/PR/8/34株为重组流感病毒骨架,利用反向遗传技术拯救冷适应致弱的重组A型人流感病毒。方法对冷适应、温度敏感、减毒的A/Ann Arbor/6/60(H2N2)流感病毒株的PB2基因片段,进行了全基因序列合成,同时人工引入PB2265(N265S)氨基酸的突变。PB2基因片段通过与改造后的转录/表达载体pAD3000连接,构建PB2基因的拯救载体。该重组质粒与PR8进行“7+1”组合的病毒拯救,共转染COS-1细胞。结果经测序获得序列准确的拯救质粒pMDV-A-PB2,利用反向遗传技术成功拯救出了具有血凝性(1×25)的冷适应的重组A型流感病毒。结论利用反向遗传技术成功拯救冷适应致弱的重组A型人流感病毒,该系统为深入研究甲型人流感病毒的基因功能和新型疫苗研发奠定了基础。