红冬孢酵母Δ^(12)-脂肪酸脱氢酶基因的克隆和表达

Δ^(12)-脂肪酸脱氢酶是多不饱和脂肪酸合成的关键酶.参考已知的Δ^(12)-脂肪酸脱氢酶基因序列设计特异性引物,通过PCR扩增从红冬孢酵母YM25235中获得了全长为1 341 bp的一个cDNA序列.序列分析表明,该序列具有一个编码446个氨基酸、相对分子质量为50.6 ku的完整开放阅读框,所编码的氨基酸序列与Δ^(12)-脂肪酸脱氢酶相似性最高但并不相同,而且也具有Δ^(12)-脂肪酸脱氢酶特异性的3个组氨酸保守区,表明该序列为一个新的编码Δ^(12)-脂肪酸脱氢酶的基因.为了验证功能,将该基因序列克隆到表达载体pYES3/CT中,构建重组质粒pY3RKD12,并转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INVSCI中进行异源表达.通过脂肪酸气相色谱(GC)分析表明,在pY3RKD12转化的酵母细胞总脂肪酸中出现一个保留时间和亚油酸甲酯标准品相同的新峰,其含量占酵母总脂肪酸的3.76%,但在pYES3/CT转化的酵母细胞总脂肪酸中没有检测到.这些结果证明所克隆的序列是一个新的Δ^(12)-脂肪酸脱氢酶基因,其表达的蛋白质可催化油酸合成亚油酸.