马杜拉放线菌对柔红霉素转化的酶学研究

洋红霉素产生菌玫瑰紫马杜拉放线菌(Actinomadura roseoviolacea)对柔红霉素有很强的转化能力,而且其主要转化方式亦为糖苷键的还原裂解。针对这一现象,利用该菌种对催化柔红霉素糖苷键还原裂解反应的酶作了初步研究,并探讨柔红霉素发酵生产方面的应用。 一、玫瑰紫马杜拉放线菌对柔红霉素的无细胞转化及其产物的确定: 菌种在YMG_1培养基(葡萄糖0.4％,麦芽汁1％,酵母膏0.4％,pH6.0)中培养可获得不产洋红霉素的菌体,收集菌体在0.05mol/L pH7.

细菌对MLS类和糖肽类抗生素产生耐药性的作用机制

MLS类和糖肽类抗生素在人类与细菌感染性疾病的对抗中发挥着重要作用。与其他抗生素一样,随着这些抗生素的临床使用,细菌耐药性的出现和不断发展给人们带来新的挑战。本综述对这两类抗生素的细菌耐药性产生机制进行了剖析,并就已开发的若干个新型MLS类和糖肽类抗生素作了介绍。

东方拟无枝酸菌中vcm14基因的敲除对万古霉素合成的影响

PCR-targeting是一种用于敲除或阻断放线菌染色体上某一基因的快速高效的方法。本研究利用该方法在大肠埃希菌中构建破坏粘粒cLYLH17(Δvcm14::apr),通过结合转移首次敲除东方拟无枝酸菌HCCB10007中万古霉素生物合成基因簇中推测的haloperoxidase基因——vcm14,得到一株双交换阻断突变株A.orientalis dvcm14(Δvcm14::apr)。该菌不产生万古霉素及其类似物,证实vcm14基因的编码蛋白不是haloperoxidase,且该蛋白不参与万古霉素的卤化反应,可能是万古霉素生物合成途径中的一个关键酶。本研究为阐明万古霉素生物合成途径中的卤化过程提供了有益线索。

麦角菌HCB-01712生物合成香草酸甲酯

从麦角菌(Claviceps sp.)HCB-01712的发酵液中分离纯化得到化合物HCB-01712-2,经理化分析、紫外吸收、质谱及核磁共振谱分析,确定该化合物为香草酸甲酯。微生物发酵产生香草酸甲酯未见报道。本研究首次从麦角菌发酵代谢产物中发现香草酸酯,有望替代昂贵的植物来源而成为安全的天然绿色产品。

耐甲氧西林金葡菌到万古霉素高度耐药金葡菌的发展及其感染的药物治疗

随着万古霉素用量增加,耐甲氧西林金葡菌(MRSA)对万古霉素敏感性逐渐下降。依据其对万古霉素敏感性的差异可分成异质性万古霉素中度耐药金葡菌(hVISA)、万古霉素中度耐药金葡菌(VISA)和万古霉素高度耐药金葡菌(VRSA)等3类。本文简要综述上述3类金葡菌的发展、相关耐药机制及其感染的药物治疗现状。

柔红霉素和襄樊霉素产生菌突变生物合成的研究

从柔红霉素产生菌SIPI1482和襄樊霉素产生菌SIPI80334诱变获得了阻断突变株SIPI1482-NS-4和SIPI80334-U33。利用这两株突变株,以柔红霉酮和柔红霉素为底物,获得了13-S-双氢柔红霉酮、13-R-双氢柔红霉酮、13-双氢柔红霉素、N-乙酰-柔红霉素和N-乙酰-13-双氢柔红霉素等转化产物。并讨论了不同属蒽环类抗生素产生菌对不同底物的转化特性等。

伊钮小单孢菌2-脱氧蟹肌醇氨基转移酶基因sisM的克隆与表达

从伊钮小单孢菌(Micromonospora inyoensis)中扩增到参与西索米星生物合成基因sisM,其开放阅读框长1263bp,编码含421个氨基酸残基(44.3ku)的蛋白质。经Blast比对,该蛋白与已报道的L-谷氨酰胺:2-脱氧蟹肌醇(DOI)氨基转移酶有很高的同源性,据此推测sisM是编码DOI氨基转移酶的基因。该基因在IPTG诱导下.在大肠埃希菌BL21(DE3)实现了表达,表达产物的分子量与推测的一致。这是从伊钮小单孢菌克隆到的又一参与西索米星核心基团2-脱氧链霉胺(DOS)生物合成的新基因,该基因在GenBank的登录号为EU074791。

伊尼奥小单孢菌2-脱氧蟹肌醇胺脱氢酶基因sisP的克隆与表达

目的:克隆西索米星生物合成基因——2-脱氧蟹肌胺(DOIA)脱氢酶基因。方法:以庆大霉素生物合成基因簇(AY524043)中的DOIA脱氢酶基因gntP作为参考模板设计引物,从伊尼奥小单孢菌(Micromonospora inyoensis)中,通过PCR方法扩增参与西索米星生物合成的DOIA脱氢酶基因,经测序鉴定、序列分析,并通过表达载体对该基因进行异源表达。结果:PCR扩增到一条长约1 035 bp的条带,包含一个开放阅读框长1 023 bp,推测其编码含340个氨基酸残基的蛋白质(相对分子质量约36×103),与已报道的DOIA脱氢酶同源性很高,该基因在IPTG诱导下,在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)实现过量表达,表达产物的相对分子质量与预测值一致。结论:通过PCR技术从伊尼奥小单孢菌中克隆到参与西索米星生物合成基因——DOIA脱氢酶基因,命名为sisP,GenBank登录号为EU200975。

利用高速逆流色谱分离制备达托霉素

达托霉素是一种重要的临床抗耐药菌抗生素,其分离纯化较困难。本文研究了利用高速逆流色谱法快速制备达托霉素纯品的方法。研究获得的两相系统为乙酸乙酯-正丁醇-水(2mmol/L TFA)(4:1:5 V/V),上相为固定相,下相为流动相。在该条件下通过高速逆流色谱收集纯化目标产物,并冻干后获得淡黄色的粉末,液相纯度大于95%。经UPLC-MS分析鉴定产物与达托霉素一致。该方法可以用于达托霉素纯品的快速制备。

菌株HCCB10327活性代谢产物的分离鉴定和抗HIV活性研究

目的从链霉菌中寻找抗HIV活性物质。方法对筛选得到的活性菌株进行菌种鉴定,采用大孔树脂结合制备的方法获得活性化合物,并对化合物进行了结构鉴定。结果菌株HCCB 10327初步鉴定为生二素链霉菌,活性物质经分离纯化和结构鉴定为siamycin Ⅱ和一个新的siamycin Ⅱ衍生物,这两个物质都具有较强的抗HIV活性,IC50分别为12.6和36.8μg/m L。结论首次从生二素链霉菌中发现了siamycin Ⅱ及一个新的衍生物。

在东方拟无枝酸菌中建立I-SceI内切酶介导的无标记敲除系统

目的在东方拟无枝酸菌中建立由I-Sce I介导的无标记高效重组系统。方法首先构建可用于东方拟无枝酸菌的I-Sce I操作盒,通过敲除多烯类化合物ECO-0501合成相关基因hem A2,比较操作盒使用前后获得hem A2基因双交换突变株的效率。结果在没有引入I-Sce I的情况下,随机重组的发生几率仅约2%,而导入后,由于I-Sce I酶对引入DNA位点的双链切割,导致双交换重组的发生率提高至90%以上。结论 I-Sce I系统是一种可用于东方拟无枝酸菌无标记遗传操作的有效工具。

甘氨酰四环素类新药替加环素

面对多重耐药菌的流行和扩散,临床对新的抗菌药物需求非常迫切。新一类甘氨酰四环素类抗生素新近问世,其首个上市药物替加环素对革兰阳性或革兰阴性菌均具有广谱抗菌活性,特别是对临床某些重要的耐药菌具有很高的活性。已有临床研究显示,替加环素疗效和耐受性均良好可用于复杂性成人腹腔感染(cIAI)和复杂性皮肤及软组织感染(cSSSI)。

FADH_2-依赖型卤化酶阳性放线菌1076的筛选、分类鉴定及其代谢产物的结构研究

目的筛选FADH2-卤化酶阳性菌株发现天然卤化物。方法设计新的简并引物对200株放线菌基因组卤化酶基因扩增以筛选阳性菌株,并进行比对分析;对阳性菌株进行分类鉴定,对其代谢产物进行HPLC-MS分析。结果筛选得到到51株阳性菌,其中一株与恩拉霉素的同源性为99%。对该编号为1076的菌株进行的分类鉴定结果,确定为Streptomyces macrosporeus。对其代谢产物进行的HPLC-MS分析显示,其代谢产物与恩拉霉素同质。结论卤化酶阳性菌株1076属于S.macrosporeus的一个菌株,是新的恩拉霉素产生菌。

有效降解万古霉素废水COD的真菌菌株筛选及研究

从本实验室保存的447株真菌中筛选出1株能有效降解万古霉素废水COD的真菌HCCB00304。通过形态观察及分子生物学分析,鉴定该菌株为绿僵菌。利用真菌HCCB00304处理万古霉素废水的最佳条件为:菌体投加量10%(体积分数)、初始pH6.00、25℃、处理时间60h,在此条件下可使废水的COD从114208mg/L降到56145mg/L,COD降解率为50.84%。反应动力学分析表明,COD降解呈一级反应动力学过程,其降解速率常数为0.0133h-1。

达托霉素前体脱酰酶产生菌的筛选

筛选得到一株对达托霉素前体具有脱酰基转化作用的游动放线菌(Actinoplanes sp.HCCB10085),经试验得到其产生脱酰基酶的最佳培养条件为pH7.0、28℃培养60～90h;菌体对达托霉素前体的最佳转化条件为pH7.0、35℃。

细菌作为抗肿瘤剂的研究进展

厌氧和兼性厌氧细菌能够专一性地优先累积在肿瘤的低氧量和坏死的区域,这使其具有很好的靶向性。它们能够分泌毒素或水解酶以及引起针对肿瘤的免疫反应,具有溶瘤作用。基因工程技术能够改造这些细菌使其具有抗肿瘤的特性,进一步增加治疗效果。最新的研究发现,这些细菌的某些代谢产物也具有增强肿瘤治疗效果的作用,为肿瘤的治疗提供了新的思路。本文对细菌作为抗肿瘤剂的相关研究进行综述。

siRNA沉默RPL31表达对胰腺癌PANC-1细胞增殖的抑制作用

目的:观察siRNA沉默核糖体蛋白L31(ribosomal protein L31,RPL31)基因表达对人胰腺癌PANC-1细胞的影响.方法:针对RPL31基因设计了3条siRNA,使用脂质体LipofectamineTM2000转染人胰腺癌PANC-1细胞,同时设立空白对照组和阴性对照组,转染成功后通过实时定量PCR及Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测RNA干扰沉默RPL31基因的效果,四氮唑盐比色法(MTT)检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期分布,Transwell小室检测细胞迁移,ELISA检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达.结果:转染48h后,3条siRNA能显著抑制RPL31基因mRNA和蛋白的表达;MTT结果显示,PANC-1细胞增殖明显受到抑制;细胞周期分布中G0/G1期明显增加、S期减少(G0/G1:59.85%±5.47%vs45.71%±3.44%;S:28.63%±4.52%vs45.13%±2.64%,均P<0.05);转染后细胞迁移数目(178.6个±30.3个)较空白对照组(470.5个±22.8个)与阴性对照组(474.2个±20.4个)明显减少,差异显著(P<0.05);转染后PANC-1细胞的VEGF表达量也明显减少[1563.45pg/(106cell24h)±24.95pg/(106cell24h)vs2804.6pg/(106cell24h)±40.46pg/(106cell24h),2791.5pg/(106cell24h)±44.77pg/(106cell24h)].结论:RPL31siRNA能明显抑制PANC-1细胞RPL31的表达,抑制细胞增殖,降低细胞迁移及VEGF表达,RPL31基因有可能成为胰腺癌基因治疗的新靶点.

夏枯草植物内生真菌CPCC 480171抗肿瘤活性成分的研究

利用硅胶柱色谱、凝胶色谱、制备高效液相色谱等方法,对一株分离自夏枯草内生真菌中具抗肿瘤活性代谢产物进行研究,从菌株发酵产物中分离得到单组份,根据理化性质及有机波谱鉴定其化学结构。结果:分离得到3个活性化合物,结构鉴定分别为:链格孢毒素Altertoxin-I,4’,5,7-三羟基异黄酮,4’,7-二羟基异黄酮。对其进行了抗肿瘤活性实验。分离得到的3个化合物均具有不同程度的抗肿瘤作用。

弹性蛋白水解物的制备

用碱性蛋白酶水解牛颈部韧带弹性蛋白,酶促反应条件是:pH10,温度不高于45℃,尿素浓度0.37M,反应时间10~11h。经葡聚糖凝胶 G-50层析制得的弹性蛋白水解物平均分子量1000~5000,主要成分是酸性多肽。

微生物来源的Hsp90抑制剂研究进展

热休克蛋白90(Hsp90)是一种分子伴侣,它的效应蛋白多为细胞内信号转导通路的关键蛋白,参与肿瘤的发生与发展。抑制Hsp90,可在多个通路中产生抗肿瘤效应。因此寻找和开发Hsp90抑制剂已成为肿瘤治疗药物的研究热点。本文综述微生物来源的Hsp90抑制剂及其衍生物的研究进展。