第四讲 重型肝炎实验室检测的临床意义

本专题讲座 ,由我刊副总编辑聂青和博士组稿并承担多讲的撰稿 ,共 14讲 ,约 6万 8千字。第一讲重型肝炎的临床分型及诊断标准 (周永兴 ) ;第二讲重型病毒性肝炎的病理学特点及研究现状(郎振为 ) ;第三讲内毒素血症在重型肝炎发病中的地位 (聂青和 ) ;第四讲重型肝炎实验室检测的临床意义 (罗新栋 ,聂青和 ) ;第五讲重型肝炎并发肝性脑病的诊治进展 (聂青和 ,毛青 ) ;第六讲重型肝炎并发上消化道出血的诊治进展 (申德林 ,王全楚 ,焦栓林 ) ;第七讲重型肝炎并发肝肾综合征的诊治进展(焦成松 ,聂青和 ) ;第八讲重型肝炎并发自发性细菌性腹膜炎的诊治进展 (王全楚 ,聂青和 ) ;第九讲重型肝炎的综合支持治疗 (宋喜秀 ) ;第十讲重型乙型肝炎的抗病毒治疗新进展 (江河清 ) ;第十一讲糖皮质激素在治疗重型肝炎中的应用及评价 (张绪清 ,聂青和 ) ;第十二讲重型肝炎水、电解质紊乱和酸碱失衡的诊断与治疗 (张绪清 ,聂青和 ) ;第十三讲重型肝炎的人工肝支持治疗 (王英杰 ) ;第十四讲重型肝炎的外科治疗———肝移植 (管文贤 )。参加本讲座撰稿者 ,均为在第一线工作的专家教授 ,他们根据自身的工作实践 ,参考最新的国内外文献撰写 ,内容丰富 ,涵盖重型肝炎的方方面面 ,文字精练 ,语言流畅 ,实用性强 。

特殊人群的丙型肝炎特点及处理

1、1 流行病学 我国健康体检儿童HCV感染率约为0．7％，曾多次接受输血的患儿HCV感染率可达到22．9％．近年来根据国内存在的HCV基因型研究报道，发现常见的基因型为1-3型．目前认为感染我国人群的HCV主要是1b／Ⅱ型和2a，Ⅲ型，1a，Ⅰ型和2b／Ⅳ型少见．香港越南尚有基因6型发现．

特殊人群乙型肝炎的临床特点及处理

自1965年Blumberg发现HBsAg以来,乙型病毒性肝炎(HBV)在分子病毒学、组织病理学、免疫学、流行病学及临床诊断治疗学等方面已取得了长足的发展,一些问题得到阐明达成了共识,但仍存在许多问题,我国是乙型肝炎的高流行区,全世界的慢性乙型肝炎患者我国占50％以上,而我国的乙型肝炎防治工作存在一些国外不曾有过的问题,这些问题需要我们自己来研究解决,可以说,在乙型肝炎临床与科研过程中充满了艰辛,我国的临床医师及基础科研工作者尽管在治疗中做了大量工作,遗憾的是至今尚未有重大性突破,这使我们喜忧参半、任重而道远。在临床研究中我国与欧美存在较大的差距,除外经济、政治和学风中的一些问题外,主要存在以下一些问题:(1)临床治疗试验不规范,难以严格的按照随机、双盲、对照和多中心原则实施临床科研方案;(2)临床科研与基础实验研究结合不够,重基础研究,轻临床科研;(3)存在多经验,少证据的现象;(4)肝活体组织检查较少,尤其是治疗前、后自身对照的肝活体组织标本甚少;(5)缺乏长期随访资料,医学资料保管不善,丢失现象较为普遍;(6)国内诊断试剂质量不稳定,缺乏统一标准,大多不能通过国际质检要求,实验数据难以得到国际权威性杂志的认可;(7)临床研究及经典流行病学调研难以获得基金资助等。慢性乙型肝炎已成为相关临床医生面临的重要问题,为了更好地解决这些临床问题,我们组织国内部分专家结合个人的临床经验及科研体会,对"慢性乙型病毒性肝炎的诊断与治疗"进行讨论,目的是引导临床医生科学、准确地处理这些问题,同时进一步深入开展慢性乙型肝炎的临床实用性研究,为提高我国慢性乙型肝炎诊治水平做出应有的贡献,造福于人类,这也是本期"焦点论坛"主办者的心愿。

人滋养层细胞内丙型肝炎病毒样颗粒的免疫电镜形态学研究

目的:应用免疫电镜技术观察体外培养的人胎盘滋养层细胞感染丙型肝炎病毒(HCV)情况。方法:采用胰蛋白酶消化法及Percoll密度梯度分离法分离培养人胎盘组织中滋养层细胞,以HCVRNA阳性血清对滋养层细胞进行体外感染实验,胶体金免疫电镜检测滋养层细胞内的HCV病毒颗粒,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)定性检测滋养层细胞内HCVRNA。结果:体外培养的人胎盘滋养层细胞内可观察到胶体金颗粒吸附的病毒样颗粒,形态及直径符合HCV特点。RT-PCR定性检测结果阳性,进一步证实所观察到的病毒样颗粒为HCV。结论:HCV可感染体外培养的人胎盘滋养层细胞。

血清学诊断肝纤维化新指标——金属蛋白酶组织抑制因子检测方法学建立及应用评价

目的 自行建立一种改良固相致敏红细胞吸附技术 (SPASE)用于快速检测肝硬化病人血清中金属蛋白酶组织抑制因子 1,2 (TIMP 1和TIMP 2 ) ,同时研究TIMP 1和TIMP 2在肝硬化病人肝组织中的定位及表达状态 ,以及肝组织TIMPs与血清TIMPs的相关性。探讨血清中TIMP 1和TIMP 2可否作为肝纤维化的血清学诊断新指标。方法 应用自行建立的SPASE检测 10 82例肝病病人 (其中肝硬化 3 10例 )血清标本中的TIMP 1和TIMP 2。用原位杂交及免疫组织化学技术分别检测 40例肝硬化病人活检肝组织中TIMP 1和TIMP 2mRNA及相关抗原的表达 ,并与病人自身血清检测结果对比。另检测 2 0例正常肝组织作为对照。结果 SPASE法特异性中和抑制试验示中和抑制率均在 70 %以上 ,检测 3 10例肝硬化病人血清中TIMP 1和TIMP 2的阳性率分别为 79.68%和 65 .16%。 40例肝硬化病人肝组织中TIMP 1和TIMP 2mRNA及相关抗原表达阳性率为 10 0 % ,TIMP 1表达强度高于TIMP 2 (P <0 .0 1) ;阳性信号主要位于肝细胞胞质内 ,未见细胞核表达。 40例肝硬化肝活检病人血清检测结果 ,TIMP 1阳性率为 10 0 % ,TIMP 2阳性率为 77.5 % ( 3 1/4 0 )。正常肝组织无一例有TIMPs相关抗原表达。结论 TIMPs定位于肝硬化病人的肝细胞胞质内 。

毒素型及免疫型大鼠纤维化肝组织中金属蛋白酶组织抑制因子定位及表达差异

目的探讨人血白蛋白免疫诱导型及四氯化碳(CCl4)毒素诱导型所致大鼠肝纤维化模型肝组织中金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)定位及表达状态的差异。方法分别以20%人血白蛋白进行免疫攻击和CCl4毒素攻击大鼠,造模结束后对大鼠肝组织进行HE、VG染色及电镜观察;同时研究TIMP1、TIMP2蛋白及mRNA定位及表达状态。结果造模结束后,免疫诱导型模型肝组织病理改变具有进行性加重趋势,TIMP1、TIMP2mRNA及蛋白表达强度高、持续时间长;而毒素诱导型模型具有TIMP1、TIMP2mRNA及蛋白表达强度弱、肝纤维化持续时间短等特点。免疫诱导实验组肝脏中TIMP1、TIMP2相关抗原表达在肌成纤维细胞、成纤维细胞,以汇管区及纤维间隔中最明显,阳性信号位于细胞胞质中,未见细胞核表达。原位杂交检测结果亦相似。结论毒素诱导型肝纤维化模型自然吸收较快,不利于抗肝纤维化药物疗效的观察;免疫诱导型肝纤维化模型自然吸收时间较慢,且在造模结束后1～3个月有逐渐加重趋势,有利于抗肝纤维化药物疗效观察及肝纤维化机制研究。

正常及实验性肝纤维化大鼠肝脏中的金属蛋白酶组织抑制因子-1

目的:了解金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)在正常及实验性肝纤维化大鼠肝组织中的定位及表达状态.方法:用人血白蛋白免疫攻击的方法制备实验性免疫性肝纤维化大鼠模型,以正常大鼠为对照.采用免疫组化法及原位杂交技术分别检测肝脏中TIMP-1mRNA和相关抗原表达,同时用PCR技术检测肝脏中TIMP-1基因水平.结果:实验组肝脏中TIMP-1相关抗原表达在肌成纤维细胞、成纤维细胞,以汇管区及纤维间隔中最明显,阳性信号位于细胞胞质中,未见细胞核表达.原位杂交检测结果也展示了上述相同的分布和定位.正常大鼠肝组织中可见TIMP-1基因表达,但表达水平极低.实验组肝组织中TIMP-1呈高水平表达.结论:在肝纤维化中,成纤维细胞及肌成纤维细胞是TIMP表达的主要细胞.随着病损肝脏中肝纤维化程度的加重,TIMP-1基因表达水平随之增高.

HCV感染人滋养层细胞过程中抗体依赖性增强作用的初步研究

目的研究丙型肝炎病毒(HCV)在感染人滋养层细胞的过程中是否存在抗体依赖性感染增强(ADE)作用,探讨HCV母婴传播的分子机制。方法将HCV阳性血清以4种不同方式感染体外培养人滋养层细胞,应用RT-PCR法对标本进行HCVRNA定性检测,并进一步评估不同浓度CD16单抗对感染过程的阻断作用。此外,应用免疫电镜技术观察滋养层细胞感染HCV病毒颗粒情。结果HCVRNA在全血清组、CD81单抗阻断组及LDL-R单抗阻断组多个标本均为阳性表达,且平均拷贝数较高,在FcγRⅢ(CD16)单抗阻断组多个标本内未能检测到HCVRNA的表达,且阳性标本拷贝数较低;CD16单抗对感染的阻断作用随浓度的升高而增强;在全血清组、CD81单抗阻断组及LDL-R单抗阻断组多个标本细胞内可间断测得未脱壳的HCV病毒颗粒,CD16单抗阻断组细胞内未能检出。结论滋养层细胞膜CD81和LDL-R分子不参与HCV感染滋养层细胞的过程,而FcγRⅢ分子则与此过程密切相关。HCV感染人滋养层细胞过程中存在抗体依赖性增强作用。

激光共聚焦技术证实HCV NS5在人胎盘滋养层细胞的定位表达

目的胎盘屏障是营养物质以及某些药物、病原体、激素等从母体进入胎儿的必经之路。体外分离培养滋养层细胞是研究其功能及母体与胎儿之间物质交换的具体分子机制的细胞学基础。本研究的目的是探讨体外分离培养的人体胎盘滋养层细胞感染丙型肝炎病毒(HCV)后HCV NS5在滋养层细胞中的定位表达。方法采用胰蛋白酶消化法及Percoll密度梯度分离法分离培养人胎盘组织中滋养层细胞,以HCV RNA阳性血清对滋养层细胞进行体外感染试验,应用RT-PCR法定性及定量检测感染后细胞培养上清中HCV RNA,用激光共聚焦技术观察免疫荧光染色后HCV NS5在滋养层细胞中的定位。结果HCV感染后的细胞培养上清中可间断检测到HCV RNA,而对照组始终未检出;激光共聚焦观察显示HCV NS5主要定位于细胞核周围。结论感染HCV的人滋养层细胞中存在HCV NS5表达。此研究为进一步深入研究HCV的母婴传播分子机制奠定了实验基础。

丙型肝炎病毒持续感染对体外培养人胎盘合体滋养层细胞MMP-2和MMP-9合成分泌的影响

目的:探讨丙型肝炎病毒持续感染对体外培养人胎盘合体滋养层细胞MMP-2和MMP-9合成分泌的影响.方法:应用ELISA方法检测细胞培养上清MMP-2和MMP-9水平,分析感染组和对照组数据间的差异,并用明胶酶谱进一步验证ELISA结果,随后应用RT-PCR法分析感染对细胞proM-MP-2和proMMP-9mRNA表达的影响.结果:感染组细胞分泌MMP-2和MMP-9能力明显下降(MMP-2:t=4.186,P<0.05;MMP-9:t=2.325,P<0.05);RT-PCR结果显示感染组细胞proMMP-2和proMMP-9mRNA表达弱于对照组,但差异不明显(proMMP-2:t=1.196,P>0.05;proMMP-9:t=1.417,P>0.05).结论:丙型肝炎病毒持续感染时体外培养人胎盘合体滋养层细胞MMP-2和MMP-9合成分泌能力下降,为非特异性.

丙型肝炎疫苗研究及面临的挑战

丙型肝炎病毒(HCV)是引起人类慢性肝炎的主要病原体之一，呈世界流行，感染率为1-3％，约60％的急性丙型肝炎(HC)患者转化为慢性，而慢性患者中分别有8-46％和11-19％发展成肝硬化和肝细胞癌．到目前为止，以干扰素为主的抗病毒治疗只能使30％左右的患者得到根治，尚未发现令人满意的治疗药物．α干扰素和病毒唑对治疗丙肝有一定的效果，

一种新型传染病：严重急性呼吸综合征

"严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome,SARS)",又称为"传染性非典型性肺炎(infectious atypical pneumonia)",是由新型变异的冠状病毒感染引起的一种以肺部感染病变为主要特征的新型传染病,是一种新的、传染性强、死亡率高的急性呼吸道传染病.SARS传播速度很快,在全球广泛流行,到目前为止几个月内我国大陆、香港、台湾、北美、欧洲等33国家或地区均有发现.截止至2003-06-06,全球SARS临床诊断病例已达8 404例,累计死亡779例;在我国内地流行形势一度十分严峻,目前已经得到有效的控制.经包括我国科技人员在内的世界各国科学家的联合快速攻关,于2003-04-16 WHO正式宣布冠状病毒的变异株(SARS-CoV)是传染性非典型肺炎病原体.我们认为临床确诊SARS患者必须重视流行病学接触史、持续出现的发热、头痛等流感样症状及动态观察患者的胸片均是十分必要的.SARS目前尚无特异性治疗和预防方法,主要应用糖皮质激素、抗病毒、抗感染、机械通气、严密隔离等,新的药物和方法尚在研究中.SARS流行已严重干扰和影响了我国乃至国际社会的经济和社会发展,因此控制其流行、研究SARS科学、规范、可靠而有效的治疗方案刻不容缓.目前的研究尚存在许多待解决的问题,随着基础研究的进展,针对SARS的技术和药物终将出现,最终征服这一人类从未面临的疾病.

HCV感染实验探讨人胎盘滋养层细胞分子生物性及侵袭力

目的探讨持续感染丙型肝炎病毒(HCV)对体外培养人胎盘合体滋养层细胞分子生物学性状及其金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9合成及分泌的影响。方法分别采用Matrigel人工重建基底膜侵袭实验、MTT法细胞黏附实验、细胞移动实验,研究HCV RNA阳性患者血清感染的体外培养人胎盘滋养层细胞(感染组)侵袭能力以及侵袭相关的黏附、移动能力的改变;检测培养上清中人绒毛膜促性腺激素(HCG)浓度以评估感染对细胞激素合成、分泌能力的影响。用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞培养上清MMP-2和MMP-9水平,分析感染组和对照组(健康体检者血清培养)数据间的差异,并用明胶酶谱进一步验证ELISA结果。应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法分析感染对细胞proMMP-2和proMMP-9 mRNA表达的影响。结果感染组细胞侵袭、黏附、移动以及激素合成、分泌能力较对照组细胞均显著下降(P<0.05)。感染组细胞分泌MMP-2和MMP-9能力明显下降(与对照组比较,MMP-2:t=4.186,P<0.05;MMP-9:t=2.325,P<0.05);RT-PCR结果显示感染组细胞proM-MP-2和proMMP-9 mRNA表达弱于对照组,但差异无显著性(proMMP-2:t=1.196,P>0.05;proMMP-9:t=1.417,P>0.05)。结论持续HCV感染的体外培养人胎盘合体滋养层细胞MMP-2和MMP-9合成、分泌能力下降。持续感染HCV可抑制体外培养人胎盘合体滋养层细胞包括侵袭能力和激素合成、分泌能力在内的多种生物学功能。

肝肾综合征药物治疗及评价

肝肾综合征（hepatorenal syndrome．HRS）是重症肝病晚期患者常见的严重并发症．其发生率为60％～80％。重症肝病患者一旦并发HRS则预后极差，病死率极高．是重症肝病最常见的直接的死亡原因之一。现重点介绍肝肾综合征的药物治疗及评价。

人CD81真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的表达

目的:构建含人CD81基因的真核表达载体,探讨CD81在COS-7细胞的表达,为研究丙型肝炎病毒(HCV)与CD81 相互作用奠定基础. 方法:从我们构建的含人CD81全编码基因载体pMD18-T- CD81,应用双酶切回收基因片段,定向克隆入真核表达载体pVAXl;通过脂质体介导的基因转染技术将pVAXl- CD81和空载体转入COS-7细胞;应用抗CD81单克隆抗体通过间接免疫荧光法检测COS-7细胞的表达产物. 结果:重组的含CD81基因的真核表达载体pVAXl-CD81 经酶切和PCR鉴定分析正确,并证明在COS-7细胞表面有效地表达CD81蛋白. 结论:成功构建含CD81全编码基因的真核表达载体pVAXl-CD81,并在COS-7细胞表面有效表达CD81分子, 该转染细胞可作为研究CD81在HCV感染中的作用提供模型.

体外感染实验探讨丙型肝炎病毒的ADE分子机制

目的研究丙型肝炎病毒(HCV)在感染人滋养层细胞的过程中是否存在抗体依赖性感染增强(ADE)作用,以探讨HCV母婴传播的分子机制。方法将HCV阳性血清以4种不同方式感染人滋养层细胞,以免疫电镜观察HCV病毒颗粒在滋养层细胞中的表达,应用RT-PCR法、免疫组化法检测细胞内外的HCVRNA正链、负链,HCVNS5、NS3及C区抗原。结果在滋养层细胞胞浆内发现了HCV病毒颗粒,HCVRNA正链、负链,HCVNS5、NS3、C区抗原仅在全血清感染细胞内或上清中间断测得。结论HCV可以在滋养层细胞中复制。HCV感染滋养层细胞的过程中存在ADE机制,抗体和补体均参与了HCV的跨膜转运过程。