葡萄糖氧化酶在无孢黑曲霉中的重组表达及酶学性质

针对目前食品级葡萄糖氧化酶的工业生产产量不高,选择黑曲霉CBS513.88的葡萄糖氧化酶基因goxC,通过密码子优化、信号肽替换对其编码区进行改造,并利用强启动子PglaA、杂合启动子Pna2/tpi及营养缺陷标记pyrG构建表达载体,旨在构建高活力的葡萄糖氧化酶表达工业菌株。goxC表达载体转化低蛋白背景的黑曲霉SH2原生质体后,经营养缺陷标记pyrG筛选获得重组菌株,邻联茴香胺显色和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳结果显示,在SH2宿主中成功表达葡萄糖氧化酶,蛋白质大小约为80 kDa。500 mL摇瓶发酵在第7天时酶活力可达563.8 U/mL;50 L发酵罐发酵在179 h时酶活力最高,达到1128 U/mL,相比摇瓶发酵提高了1倍多,在目前曲霉表达系统的相关表达研究中,本研究葡萄糖氧化酶表达量已达到较高的水平。酶学性质研究发现,重组葡萄糖氧化酶最适pH值为5.5,最适温度为45℃。综上所述,本研究成功实现了葡萄糖氧化酶在黑曲霉中的高效重组表达。

重组猪圆环病毒2型Cap蛋白在毕赤酵母中的优化表达及疫苗活性研究

猪圆环病毒2型(PCV2)是引起断奶猪多系统衰竭综合症(PMWS)的主要致病原,在全世界范围内对养猪业造成了巨大的经济损失。猪圆环病毒2型Cap蛋白(PCV2-Cap)是制备猪蓝耳病疫苗的主要靶蛋白。针对目前PCV2疫苗生产工艺复杂、成本较高的问题,本研究利用毕赤酵母表达系统研究PCV2-Cap蛋白的重组表达及疫苗活性,将PCV2-Cap基因序列去除核定位信号序列(NLS)后,经密码子偏好性优化,构建重组表达载体,并转化至毕赤酵母宿主菌X-33,经Zeocin抗性筛选获得重组菌株。SDS-PAGE和Western blot结果显示Cap蛋白在酵母表达系统中成功表达,蛋白质大小为26 ku。5 L罐高密度发酵小试,得到PCV2-Cap蛋白在发酵上清液中的浓度约为0.53 mg/m L,占总蛋白的23.5%。动物免疫试验显示重组Cap蛋白能刺激机体产生特异性抗体。结果表明,PCV2-Cap基因在毕赤酵母中实现了分泌表达,为PCV2-Cap毕赤酵母亚单位疫苗的研制提供了数据支持。