花烟草NaD1基因的表达及其启动子序列分析

花烟草(Nicotiala alata)的花中存在的植物防御素Nicotiala alata defensin 1(NaD1),对多种致病性真菌具有防御活性,在天然防御免疫系统中发挥着重要作用。本研究分别对花烟草根、茎、叶、花组织部分以及伸根期、旺长期、成熟期发育阶段叶片中NaD1基因的表达量进行qRT-PCR定量检测,结果显示,NaD1基因在花中表达量显著高于其他组织,在叶片中的表达量随着植物的生长发育先增加后降低。此外,通过热不对称交错PCR克隆得到NaD1基因5′端上游644 bp的片段,利用BDGP和Plant CARE在线软件分析启动子的转录起始位点及motif元件,发现其含有基本启动子元件和其他顺式作用元件,如光反应元件BOX-Ⅰ、乙烯反应元件ERE以及真菌诱导响应元件TGACG-motif等。通过对花烟草进行光胁迫处理,发现NaD1基因在花中的表达量随着暗处理时间的增长而显著增加,随着光处理时间的增长而显著降低,这与其启动子中存在的光反应元件BOX-Ⅰ相对应。通过启动子5′端缺失分析,构建了pCAMBIA1391z-pNaD1-644∶∶GUS与pCAMBIA1391z-pNaD1-310∶∶GUS两个植物表达载体,利用遗传转化获得包含-644~-1 bp和-310~-1 bp启动子片段的转基因烟草,GUS染色结果表明,NaD1基因启动子的核心区域在-310~-1 bp中,为进一步研究NaD1基因的功能和转录调控机制奠定了基础。

花烟草NaD1基因的原核表达及纯化

花烟草的花中特异地存在一种植物防御素Nicotiala alata defensin 1(NaD1),对多种致病性真菌具有防御活性,在天然免疫系统中起着重要作用。该蛋白还对哺乳动物肿瘤细胞具有杀伤作用。本研究构建了原核表达载体p ET28a-NaD1,将其转化到Rosetta菌株中进行诱导表达并优化了诱导表达条件,发现在25℃下,0.5 mmol/L IPTG诱导表达过夜后,目的蛋白积累量达到最高,并主要以可溶性蛋白形式存在。利用Ni柱对NaD1重组蛋白进行亲和层析纯化,产物经Western Blot鉴定发现在16.8 kD处有特异性条带,与预期的NaD1重组蛋白大小一致。本研究结果为进一步研究NaD1蛋白的作用机制提供实验依据。