利用CRISPR/Cas9技术构建Fbxw7敲低的Raw264.7稳定细胞株及其生理功能检测

目的:应用CRISPR/Cas9技术构建Fbxw7表达抑制的Raw264.7稳定巨噬细胞株,并检测其生理功能。方法:转染Fbxw7_Cas9KO质粒到Raw264.7细胞,用含嘌呤霉素的培养基培养,挑取单克隆并筛选带荧光标记的细胞进一步培养;然后采用qRT-PCR和Western blot分别检测Fbxw7基因与蛋白表达水平;Confocal进一步检测Fbxw7蛋白表达分布;测序分析基因突变情况;CCK-8和流式细胞术分别检测Fbxw7基因敲低后Raw264.7细胞增殖能力与凋亡率。结果:Fbxw7敲低组的mRNA和蛋白表达水平较正常Raw264.7细胞显著降低,Confocal观察发现敲低组Raw264.7细胞中Fbxw7蛋白表达微弱;测序结果显示Fbxw7敲低组存在多位点突变;Fbxw7敲低后Raw264.7细胞增殖能力明显降低,凋亡率增加。结论:利用CRISPR/Cas9技术可以实现Fbxw7基因在Raw264.7细胞稳定低表达,所筛选出的稳定细胞株可用于后续细胞水平的实验研究。

Tet1对宿主抗海分枝杆菌感染的意义与机制研究

目的探讨宿主Tet1(ten-eleven translocation)分子在抗海分枝杆菌感染过程中的意义与初步机制。方法SPF级野生型C57BL/6和Tet1基因敲除小鼠(Tet1KO)分别尾静脉接种海分枝杆菌,建立尾静脉感染模型。首先观察比较大体病变如尾巴脓肿形成及面积差异;再用苏木精-伊红染色法染色及透射电镜观察小鼠尾组织病理学变化与差异;免疫组化检测小鼠尾组织中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和转化生长因子β(TGF-β)的表达与分布;组织研磨涂抹于7H10固体培养基,计数菌落并统计差异;最后,提取尾组织蛋白,Western blot检测NF-κBp65和TGF-β的表达。结果C57BL/6小鼠感染海分枝杆菌后尾巴上形成明显的脓肿、溃疡等病变;而Tet1KO小鼠病变较轻,仅出现散在的小脓肿,并且尾组织菌载量明显降低。组织病理学观察发现感染海分枝杆菌后,C57BL/6小鼠尾组织中有明显的炎性细胞聚集和浸润,形成肉芽肿样病灶,而Tet1KO小鼠尾组织中无明显炎性细胞浸润;免疫组化检测发现Tet1KO小鼠尾组织中的TNF-α和TGF-β的表达量均比C57BL/6组降低;Western blot检测发现Tet1KO小鼠尾组织中磷酸化NF-κBp65和TGF-β蛋白表达水平显著降低。结论Tet1缺失可以降低海分枝杆菌介导的炎性损伤,且利于宿主对细菌的清除。