酵母双杂交筛选PMEPA1互作蛋白

采用酵母双杂交技术筛选与前列腺跨膜蛋白PMEPA1相互作用的蛋白质,构建了pGBKT7-PMEPA1诱饵质粒,获得与PMEPA1互作蛋白,GST pull-down实验确定2种蛋白间的相互作用.构建了诱饵载体转化酵母菌Y2HGold,对酵母宿主无毒性、无自激活活性.得到阳性克隆Dynactin6,GST pull-down实验证实PMEPA1与Dynactin6蛋白间相互作用.推测蛋白Dynactin6可能参与调控PMEPA1在细胞的运输.

TMEPAI蛋白表达对溶酶体稳定性的影响

本研究旨在构建稳定表达TMEPAI细胞株,研究TMEPAI表达对溶酶体稳定性的影响.采用基因工程技术构建重组表达载体p EF-IRES-TMEPAI-Flag,经酶切、PCR检测及测序鉴定,证实表达质粒构建正确.将表达质粒转染A549肺癌细胞,经抗生素puromycin筛选单克隆阳性细胞株,采用免疫印迹实验(Western blot)和免疫荧光技术证实稳定表达TMEPAI细胞株构建成功.通过MTT法、流式细胞技术和吖啶橙染色实验表明,TMEPAI蛋白能够增强溶酶体的稳定性.

绿豆胰蛋白酶抑制剂BBI诱导肺腺癌A549细胞凋亡

研究了绿豆胰蛋白酶抑制剂BBI对人肺腺癌A549细胞增殖抑制作用和对肺腺癌A549细胞凋亡的影响.结果显示:绿豆BBI对人肺腺癌A549细胞的增殖有明显抑制作用,绿豆BBI可以促使人肺腺癌A549细胞出现明显的染色质浓缩和凋亡小体,诱导人肺腺癌A549细胞的凋亡.说明绿豆BBI能抑制人肺腺癌A549细胞增殖、诱导人肺腺癌A549细胞凋亡,为绿豆BBI抗肿瘤效应提供了依据.

重组绿豆BBI(6-33)结构域的抗肿瘤作用分析

通过大肠杆菌外源表达绿豆BBI蛋白抗肿瘤活性结构域,研究纯化后的BBI蛋白抗肿瘤活性结构域蛋白对肿瘤细胞增殖、凋亡和迁移的影响及引起肿瘤细胞凋亡的分子机制.MTT、DAPI染色、克隆形成、划痕实验等结果表明,重组BBI(6-33)域对A549等肿瘤细胞的增殖和迁移有抑制作用,对其凋亡则起促进作用.Western blot分析显示,重组BBI(6-33)域可激活caspase-3、caspase-9、p21等表达,提示其诱导肿瘤细胞凋亡作用可能主要是通过线粒体途径发挥的.

一种基于全自动多重裂解滤膜法的研究应用

多重裂解滤膜法结合了差异裂解法及滤膜法的优点,经两次短时裂解后可快速去除女性成分细胞并将精子细胞截留在滤膜上,再经深度裂解即可将精子细胞DNA释放,裂解产物则使用磁珠法进行提取纯化。该方法在法医专用核酸提取工作站上实现了全自动化工艺,可在180min内完成24个混合斑样本的分离提纯。使用全自动多重裂解滤膜法对223例性侵案件样本进行了提取测试,统计98例PSA阳性样本中的83例得到有效的单一男性分型,检出率可达84.7%,优于传统差异裂解法。

PMEPA1蛋白的原核表达、纯化及其抗体制备

为了从蛋白水平上检测前列腺跨膜蛋白PMEPA1(prostate transmembrane protain,androgen induced 1)在细胞内的表达和功能,构建了原核表达重组质粒pTrcHisA-PMEPA1和pGEX4T-2-PMEPA1,转化大肠杆菌BL21-RIPL后,IPTG诱导蛋白表达,分别用Ni-NTA和谷胱甘肽琼脂糖凝胶层析柱纯化蛋白。用His-PMEPA1免疫兔子制备抗体,并用GST-PMEPA1对抗体进行纯化。免疫印迹检测显示抗体能够特异识别细胞中内源PMEPA1蛋白。