禽传染性支气管炎病毒感染性克隆的快速构建及应用

为构建高效且易于操作传染性支气管炎病毒(IBV)基因组的反向遗传学平台,本研究将IBV H120株全基因组经RT-PCR分段扩增,并在其基因组的5'端引入人巨细胞病毒(CMV)启动子序列以及3'端引入丁型肝炎病毒核酶序列(HDVRz)和牛生长激素(BGH)多聚腺苷酸化信号序列(后续称HB序列),获得H120株基因组的9个片段(CMV-F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7、F8和F9-HB);其中片段F7通过引物引入沉默突变C20356T作为遗传标记。采用转化偶联重组(TAR)克隆技术将9个DNA片段与线性质粒p YES1L转化酿酒酵母细胞,快速构建H120株基因组全长cDNA克隆,经连接PCR(Junction-PCR)筛选及测序鉴定获得感染性克隆质粒p YES1L-H120。为了提高病毒拯救效率,同时构建表达IBV N蛋白的辅助质粒pcDNA3.1-N+3'UTR。将p YES1L-H120与pcDNA3.1-N+3'UTR共转染BHK-21细胞,48 h后收获细胞,接种9日龄SPF鸡胚盲传3代,经胚体病变观察和测序显示获得IBV反向遗传重组病毒r H120株。为了以IBV为载体表达外源基因,本研究将病毒基因组的5a基因替换为eGFP基因,采用TAR克隆技术构建以IBV为载体表达外源e GFP基因的cDNA克隆pYES1L-H120-Δ5a-eGFP,与辅助质粒共转染BHK-21细胞,随后接种SPF鸡胚拯救嵌合病毒r H120-Δ5a-eGFP,并采用PCR和测序鉴定该重组病毒正确构建。结果显示,采用TAR克隆技术能够在短时间内获得IBV反向遗传重组病毒且快速操作病毒基因组获得以IBV为载体稳定表达外源基因的嵌合病毒。本研究首次建立了基于TAR克隆技术的IBV反向遗传操作平台,为研究病毒的生物学特性、载体疫苗的开发和抗病毒药物的筛选提供高效便捷的工具。

甲型流感病毒A/WSN/1933(H1N1)感染A549细胞的circRNA表达谱分析与鉴定

环状RNA(circRNA)已被证明在众多生物过程中起着重要的调控作用,而circRNA在甲型流感病毒(IAV)复制过程中的功能尚不清楚。本研究旨在利用高通量测序分析IAV感染A549细胞后的circRNA表达谱变化来挖掘能够影响病毒复制的circRNAs并对其进行初步功能鉴定。利用测序结果,对全部circRNAs进行特征分析、差异表达筛选;对差异circRNAs进行GO分析、KEGG分析;对候选circRNAs进行qPCR、RT-PCR验证及Sanger测序鉴定,并通过空斑试验确定影响病毒复制的circRNAs。结果:本试验共筛选到11 630条差异表达circRNAs,对其中6条circRNA进行了鉴定,最终确定novel_circ_007428具有抗病毒作用。本研究对甲型流感病毒感染A549细胞后的circRNA表达谱进行了分析与鉴定,为进一步研究circRNA在流感病毒感染中发挥的调控作用奠定了基础。