微小RNA-221-3p通过DDIT4抑制镉诱导的TM3细胞凋亡机制

目的探讨微小RNA(microRNA,miRNA)中的miR-221-3p靶向DNA损伤诱导转录本4(DNA-damage-inducible transcript 4,DDIT4)对镉诱导小鼠睾丸间质细胞凋亡的影响和机制。方法小鼠睾丸间质细胞(mouse testicular stromal cells,TM3)经不同浓度的镉(0、10、20、30和40μmol/L)染毒后,使用CCK-8检测细胞活性。提取镉染毒TM3细胞的总RNA,以差异倍数(fold change,FC)>1.2,P<0.05作为标准筛选显著差异表达miRNA。TM3细胞分为空白对照组、阴性对照组、镉染毒组(CdCl2,20μmol/L)和镉染毒+miR-221-3p模拟物组,其中对镉染毒+miR-221-3p模拟物组,先将miR-221-3p模拟物转染进TM3细胞,再联合镉染毒24 h。Hoechst染色检测细胞形态,流式细胞仪分析细胞凋亡率,实时荧光定量PCR和Western blot免疫印迹法检测DDIT4表达水平,双荧光素酶报告基因实验验证miR-221-3p与DDIT4的结合,生物信息学分析DDIT4的功能及与细胞凋亡的关联,过表达miR-221-3p后观察B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)和B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,BAX)的表达水平。结果镉染毒可降低TM3细胞活性且存在剂量-效应关系。细胞形态学发现,与对照组相比,镉染毒组细胞皱缩、细胞核浓染,凋亡率升至19.66%±0.45%(P<0.01);与镉染毒组相比,镉染毒+miR-221-3p模拟物组正常形态细胞增多,凋亡率降至13.76%±0.37%(P<0.05)。镉染毒组miR-221-3p表达水平下调(P<0.01),DDIT4表达水平上调(P<0.05)。生物信息学分析和双荧光素酶报告分析发现DDIT4为miR-221-3p的靶基因之一。与镉染毒组相比,镉染毒+miR-221-3p模拟物组DDIT4表达水平下调(P<0.05),Bcl-2/BAX比值由0.54±0.03增加为0.71±0.04。结论miR-221-3p通过靶向DDIT4进而抑制镉诱导的TM3细胞凋亡。

miRNA转录组学分析镉致小鼠睾丸间质细胞毒性作用机制

目的运用转录组测序及生物信息学技术,探讨镉通过调控微小RNA(microRNA,miRNA)引起小鼠睾丸间质细胞(TM3)毒性的机制。方法选取TM3为细胞模型,分为对照组(不予镉处理)和镉染毒组(20μmol/L CdCl_(2)),24 h后收获细胞提取总RNA,通过RNA质量检测后上机执行测序程序得到miRNA的表达谱。以差异倍数(fold change,FC)>2,P<0.05作为标准筛选显著差异表达miRNA,并采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)对差异表达miRNA进行验证。同时,利用miRanda软件预测其靶基因,构建miRNA-靶基因互作网络并对靶基因进行基因本体学(gene ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)功能富集分析。结果筛选出镉致TM3细胞毒性相关的26个显著差异表达miRNA,其中19个显著上调,7个显著下调。qRT-PCR对其中3个差异miRNA进行表达量的验证,结果与转录组测序相一致。生物信息学分析结果显示:26个差异表达miRNA共预测到657个靶基因,GO富集主要归类于生物调控、代谢过程、蛋白结合和催化活性等方面;KEGG通路注释表明靶基因主要富集于丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)等与炎症反应、细胞凋亡密切相关的经典信号通路(P<0.05)。结论镉可导致TM3细胞差异表达miRNA,其靶基因可能通过MAPK、TNF等信号通路参与镉引起的TM3细胞毒性。