痘苗病毒天坛株N1L基因表达调控序列的克隆与特性分析

本研究以痘苗病毒天坛株(Vaccinia Virus Tian Tan Strain,VTT)为对象,旨在明确N1L基因的表达调控序列。我们克隆了N1L起始密码子ATG上游不同长度的调控序列片段,构建了表达载体,并利用报告基因萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase,Fluc)的表达来确定N1L表达调控序列区域。通过PROMO在线预测网站,预测了与调控序列结合的转录因子。结果显示,VTT中N1L基因的表达受到上游调控序列的调控,其中以-404bp起始的片段启动的Fluc表达量最高。PROMO预测表明该区域存在多个转录因子结合位点。本研究为痘苗病毒基因表达特点的研究提供了实验依据,并为N1L基因功能及机制研究奠定了基础。

基于RAA-CRISPR/Cas12a的猴痘病毒核酸检测方法的建立

目的建立一种基于RAA-CRISPR/Cas12a的特异性强、灵敏度高的猴痘病毒核酸检测方法。方法根据已知猴痘病毒基因保守区设计合成重组酶介导等温核酸扩增(recombinase-aided amplification,RAA)引物和成簇规律间隔的短回文重复序列RNA(clustered regularly interspaced short palindromic repeats RNA,CRISPR RNA,crRNA),利用荧光检测技术筛选特异crRNA,通过荧光计数读取CRISPR/Cas12a检测结果,同时对所建立方法的灵敏性和特异性进行评价。结果建立了基于RAA-CRISPR/Cas12a的猴痘病毒核酸检测方法,其灵敏度为2.5拷贝/反应,且与鼠痘病毒、痘苗病毒无交叉反应,具有高特异性。结论建立了基于RAA-CRISPR/Cas12a的猴痘病毒核酸检测方法,为高效、快速、特异性检测猴痘病毒感染提供了有力工具。

CRISPR/Cas系统在新型冠状病毒分子检测中的应用研究进展

新型冠状病毒(2019 novel coronavirus, 2019-nCoV)引发的新型冠状病毒肺炎(Coronavirus Disease 2019, COVID-19)疫情已造成全球严重的公共卫生问题。2019-nCoV变异株不仅毒力发生变化, 传播力增强, 这些特性的改变已引发持续关注。快速、准确、有效的检测方法对于COVID-19疫情防控至关重要。基于成簇规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)及相关蛋白(CRISPR-associated, Cas)的核酸检测方法具有特异性强、灵敏度高、快速、便携、价廉的特点, 在2019-nCoV分子检测中显示出较好的应用前景。本文对CRISPR/Cas系统在2019-nCoV检测中的应用进行了综述, 以期为疫情防控提供参考。

新型冠状病毒监测网络省市级疾控实验室核酸检测室间质评

目的对全国32个省市级疾控机构新冠监测网络实验室新型冠状病毒(新冠病毒)变异株核酸检测能力进行室间质评,同时对常规所用新冠病毒核酸检测试剂性能进行评价。方法制备新冠病毒武汉株及4个关切变异株、人冠状病毒OC43(HCoV-OC43)和H3亚型流感病毒(H3N2)核酸样本,发放给全国31个省、自治区及直辖市和新疆生产建设兵团疾病预防控制中心新冠监测网络实验室进行室间质评。每个实验室的考核样本盘包括两种不同Ct值(~35、~30)的新冠病毒武汉株、关切变异株(α和γ或β和δ)、HCoV-OC43、流感病毒核酸样本共10支。根据反馈结果计算检测符合率并对检测结果进行深入分析。同时,收集各考核实验室常用的新冠病毒核酸检测试剂盒进行检测性能验证。结果全国省市级疾控机构新冠监测网络实验室室间质评总体达标率为100%(32/32),总体优秀率72%(23/32);初测中,新冠病毒、HCoV-OC43核酸样本检测总符合率为99.7%(319/320)、89%(57/64)。对32个考核实验室送检的新冠病毒核酸检测试剂盒进行性能验证,66%(33/50)的试剂盒检测限与说明书相符,92%(11/12)的受检试剂盒特异性达标。结论32个省市疾控机构实验室新冠病毒核酸检测能力全部达标,均能检测新冠病毒武汉株及阿尔法、贝塔、伽马和德尔塔变异株;送检的部分核酸检测试剂检测限与说明书不符,检测性能有待改进。